| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 绪论 | 第12-25页 |
| 1.1 脂肪酶简介 | 第12-15页 |
| 1.1.1 脂肪酶的定义 | 第12页 |
| 1.1.2 脂肪酶的来源 | 第12-13页 |
| 1.1.3 脂肪酶的分类 | 第13页 |
| 1.1.4 脂肪酶的应用 | 第13-14页 |
| 1.1.4.1 食品工业 | 第13页 |
| 1.1.4.2 医药和化妆品 | 第13-14页 |
| 1.1.4.3 化工产品 | 第14页 |
| 1.1.4.4 生物柴油 | 第14页 |
| 1.1.5 脂肪酶的理化性质和催化机理 | 第14-15页 |
| 1.2 大肠杆菌表达外源基因的概述 | 第15-18页 |
| 1.2.1 表达载体 | 第16页 |
| 1.2.2 受体菌株 | 第16-17页 |
| 1.2.3 培养基的配置 | 第17-18页 |
| 1.2.4 温度 | 第18页 |
| 1.2.5 pH | 第18页 |
| 1.2.6 溶氧量 | 第18页 |
| 1.2.7 其他因素 | 第18页 |
| 1.3 酶的固定化 | 第18-22页 |
| 1.3.1 固定化酶的产生和发展 | 第18-19页 |
| 1.3.2 酶的固定化方法 | 第19-22页 |
| 1.3.2.1 吸附法 | 第19页 |
| 1.3.2.2 共价结合法 | 第19-21页 |
| 1.3.2.3 包埋法 | 第21页 |
| 1.3.2.4 交联法 | 第21-22页 |
| 1.4 粘质沙雷氏菌脂肪酶的研究进展 | 第22-24页 |
| 1.4.1 粘质沙雷氏菌脂肪酶简介 | 第22页 |
| 1.4.2 粘质沙雷氏菌脂肪酶分子结构和分泌机制 | 第22-23页 |
| 1.4.3 粘质沙雷氏菌脂肪酶的生物催化应用 | 第23-24页 |
| 1.5 本论文的目的和意义 | 第24-25页 |
| 第2章 粘质沙雷氏菌脂肪酶的克隆及其重组表达 | 第25-43页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 实验仪器与材料 | 第25-28页 |
| 2.2.1 培养基 | 第25页 |
| 2.2.2 溶液配置 | 第25-26页 |
| 2.2.3 实验主要试剂 | 第26页 |
| 2.2.4 实验主要仪器与设备 | 第26-27页 |
| 2.2.5 菌株和质粒 | 第27页 |
| 2.2.6 引物序列 | 第27-28页 |
| 2.3 实验方法 | 第28-34页 |
| 2.3.1 细菌总DNA的抽提 | 第28页 |
| 2.3.2 PCR方法 | 第28-29页 |
| 2.3.3 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第29页 |
| 2.3.4 DNA目的产物纯化或DNA琼脂糖凝胶胶回收 | 第29页 |
| 2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第29页 |
| 2.3.6 转化大肠杆菌 | 第29页 |
| 2.3.7 质粒的提取 | 第29-30页 |
| 2.3.8 目的基因的TA克隆 | 第30页 |
| 2.3.9 目的蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第30-32页 |
| 2.3.10 SDS-PAGE检测目的蛋白 | 第32-33页 |
| 2.3.11 脂肪酶活力的测定 | 第33页 |
| 2.3.12 凝血酶切除信号肽 | 第33-34页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第34-42页 |
| 2.4.1 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)H30基因组的提取 | 第34页 |
| 2.4.2 PCR获得粘质沙雷氏菌H30脂肪酶基因 | 第34-35页 |
| 2.4.3 脂肪酶基因与pMD19-T载体连接 | 第35-36页 |
| 2.4.4 重组表达载体的构建 | 第36-37页 |
| 2.4.5 粘质沙雷氏菌脂肪酶在大肠杆菌中的表达与优化 | 第37-40页 |
| 2.4.5.1 粘质沙雷氏菌脂肪酶在大肠杆菌中的表达 | 第37-38页 |
| 2.4.5.2 不同温度对脂肪酶在大肠杆菌中表达的影响 | 第38页 |
| 2.4.5.3 不同IPTG浓度对脂肪酶在大肠杆菌中表达的影响 | 第38页 |
| 2.4.5.4 不同IPTG诱导时间对脂肪酶在大肠杆菌中表达的影响 | 第38-40页 |
| 2.4.5.5 不同Ca~(2+)浓度对脂肪酶在大肠杆菌中表达的影响 | 第40页 |
| 2.4.6 信号肽对粘质沙雷氏菌脂肪酶酶活的影响 | 第40-42页 |
| 2.5 小结 | 第42-43页 |
| 第3章 重组菌的发酵优化及发酵罐放大培养 | 第43-54页 |
| 3.1 引言 | 第43页 |
| 3.2 实验仪器与材料 | 第43-44页 |
| 3.2.1 培养基 | 第43-44页 |
| 3.2.2 实验主要试剂 | 第44页 |
| 3.2.3 实验主要仪器与设备 | 第44页 |
| 3.3 实验方法 | 第44页 |
| 3.3.1 脂肪酶酶活测定 | 第44页 |
| 3.3.2 SDS-PAGE测定目的蛋白 | 第44页 |
| 3.3.3 菌体浓度的测定 | 第44页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第44-53页 |
| 3.4.1 发酵培养基的优化 | 第44-49页 |
| 3.4.1.1 碳源的优化 | 第44-45页 |
| 3.4.1.2 葡萄糖浓度的优化 | 第45-46页 |
| 3.4.1.3 氮源的优化 | 第46-47页 |
| 3.5.1.4 磷酸盐浓度的优化 | 第47-48页 |
| 3.4.1.5 微量元素混合液的优化 | 第48-49页 |
| 3.4.2 诱导条件的优化 | 第49-52页 |
| 3.4.2.1 诱导温度的优化 | 第49页 |
| 3.4.2.2 诱导时机的优化 | 第49-50页 |
| 3.4.2.3 诱导剂(乳糖)浓度的优化 | 第50-51页 |
| 3.4.2.4 诱导时间的优化 | 第51-52页 |
| 3.4.3 在7L发酵罐中进行脂肪酶发酵 | 第52-53页 |
| 3.5 本章小结 | 第53-54页 |
| 第4章 重组脂肪酶的纯化、固定化及其酶学性质研究 | 第54-62页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 实验仪器与材料 | 第54-55页 |
| 4.2.1 实验主要试剂 | 第54页 |
| 4.2.2 实验主要仪器与设备 | 第54-55页 |
| 4.3 实验方法 | 第55-58页 |
| 4.3.1 固定化脂肪酶活力测定(比色法) | 第55页 |
| 4.3.2 蛋白浓度测定 | 第55-56页 |
| 4.3.3 脂肪酶的纯化 | 第56页 |
| 4.3.4 氨基载体的活化 | 第56页 |
| 4.3.5 离子交换树脂预处理 | 第56-57页 |
| 4.3.6 氨基载体固定化脂肪酶 | 第57页 |
| 4.3.7 环氧载体固定化脂肪酶 | 第57页 |
| 4.3.8 离子交换树脂固定化脂肪酶 | 第57页 |
| 4.3.9 最适水解温度测定 | 第57页 |
| 4.3.10 最适水解pH测定 | 第57页 |
| 4.3.11 酶的热稳定性测定 | 第57页 |
| 4.3.12 固定化酶的pH稳定性测定 | 第57-58页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第58-61页 |
| 4.4.1 粘质沙雷氏菌脂肪酶的纯化 | 第58页 |
| 4.4.2 不同载体对脂肪酶的固定化效果 | 第58-59页 |
| 4.4.3 LH-EP固定化脂肪酶的最适反应温度 | 第59页 |
| 4.4.4 LH-EP固定化脂肪酶的最适水解pH值 | 第59-60页 |
| 4.4.5 LH-EP载体固定化酶的热稳定性 | 第60-61页 |
| 4.4.6 LH-EP载体固定化酶的pH稳定性 | 第61页 |
| 4.5 本章小结 | 第61-62页 |
| 第5章 粘质沙雷氏菌H30脂肪酶不对称拆分手性醇的研究 | 第62-73页 |
| 5.1 引言 | 第62页 |
| 5.2 实验仪器与材料 | 第62-63页 |
| 5.2.1 实验主要试剂 | 第62页 |
| 5.2.2 实验主要仪器与设备 | 第62-63页 |
| 5.3 实验方法 | 第63-64页 |
| 5.3.1 催化剂的制备 | 第63页 |
| 5.3.2 手性拆分反应 | 第63页 |
| 5.3.3 HPLC检测方法 | 第63页 |
| 5.3.4 反应条件的优化 | 第63-64页 |
| 5.3.5 粘质沙雷氏菌脂肪酶对其他手性醇的拆分 | 第64页 |
| 5.3.6 粘质沙雷氏菌脂肪酶拆分地尔硫卓中间体 | 第64页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第64-72页 |
| 5.4.1 检测方法的建立 | 第64-65页 |
| 5.4.2 粘质沙雷氏菌脂肪酶催化拆分4-苯基-2-丁醇 | 第65-66页 |
| 5.4.3 温度对4-苯基-2-丁醇拆分效果的影响 | 第66-67页 |
| 5.4.4 有机溶剂对4-苯基-2-丁醇拆分效果的影响 | 第67-68页 |
| 5.4.5 不同水含量的冻干酶粉对4-苯基-2-丁醇拆分效果的影响 | 第68-69页 |
| 5.4.6 不同酰基供体对4-苯基-2-丁醇拆分反应的影响 | 第69页 |
| 5.4.7 酶添加量对4-苯基-2-丁醇拆分反应的影响 | 第69-70页 |
| 5.4.8 底物摩尔比对4-苯基-2-丁醇拆分反应的影响 | 第70-71页 |
| 5.4.9 粘质沙雷氏菌脂肪酶对其它手性醇的拆分 | 第71页 |
| 5.4.10 粘质沙雷氏菌脂肪酶拆分地尔硫卓中间体 | 第71-72页 |
| 5.5 本章小结 | 第72-73页 |
| 第6章 总结与展望 | 第73-75页 |
| 6.1 全文总结 | 第73-74页 |
| 6.2 展望 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
