| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 1 前言 | 第11-23页 |
| 1.1 微生物蛋白表达系统研究进展 | 第11-19页 |
| 1.1.1 原核表达系统 | 第11-18页 |
| 1.1.1.1 大肠杆菌表达系统 | 第11-12页 |
| 1.1.1.2 枯草芽胞杆菌表达系统 | 第12-13页 |
| 1.1.1.3 胞外蛋白酶对枯草芽胞杆菌表达系统的影响 | 第13-16页 |
| 1.1.1.4 影响外源蛋白在原核表达系统表达的其他因素 | 第16-18页 |
| 1.1.2 真核表达系统 | 第18-19页 |
| 1.1.2.1 毕赤酵母表达系统 | 第18-19页 |
| 1.2 地衣芽胞杆菌简介 | 第19-21页 |
| 1.2.1 B.licheniformis测序 | 第20页 |
| 1.2.2 B.licheniformis表达系统研究现状 | 第20-21页 |
| 1.3 纳豆激酶表达研究进展 | 第21-22页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-31页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第23-25页 |
| 2.1.2 培养基、培养温度及抗生素使用浓度 | 第25-26页 |
| 2.1.3 PCR引物 | 第26-28页 |
| 2.1.4 工具酶及试剂 | 第28页 |
| 2.1.5 抽提液和缓冲液 | 第28-30页 |
| 2.1.6 主要实验仪器 | 第30-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-42页 |
| 2.2.1 核酸水平操作 | 第31-34页 |
| 2.2.1.1 DNA的体外重组操作 | 第31页 |
| 2.2.1.2 大肠杆菌质粒的小量抽提制备 | 第31页 |
| 2.2.1.3 B.licheniformis基因组DNA的小量抽提 | 第31页 |
| 2.2.1.4 DNA的纯化回收 | 第31-32页 |
| 2.2.1.5 PCR扩增 | 第32-34页 |
| 2.2.2 载体的构建 | 第34-36页 |
| 2.2.2.1 基因敲除载体的构建 | 第34-35页 |
| 2.2.2.2 α-淀粉酶分泌表达载体的构建 | 第35页 |
| 2.2.2.3 纳豆激酶分泌表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 2.2.3 重组质粒转化 | 第36-37页 |
| 2.2.3.1 大肠杆菌感受态制备及常规转化 | 第36页 |
| 2.2.3.2 大肠杆菌重组表达菌株的菌落PCR验证 | 第36-37页 |
| 2.2.4 芽胞杆菌重组质粒转化 | 第37-38页 |
| 2.2.4.1 B.lichenifrmis的电转化 | 第37页 |
| 2.2.4.2 B.licheniformis转化子的检测 | 第37页 |
| 2.2.4.3 Blicheniformis转化子的质粒提取 | 第37-38页 |
| 2.2.5 双交换突变体的筛选及验证 | 第38页 |
| 2.2.6 摇瓶发酵培养条件 | 第38页 |
| 2.2.7 明胶酶谱实验方法 | 第38-39页 |
| 2.2.7.1 准备样品 | 第38-39页 |
| 2.2.7.2 配制含有明胶的SDS-PAGE胶 | 第39页 |
| 2.2.8 表达蛋白的鉴定 | 第39-40页 |
| 2.2.8.1 TCA(三氯乙酸)沉淀 | 第39页 |
| 2.2.8.2 SDS-PAGE电泳分析表达产物 | 第39-40页 |
| 2.2.9 α-淀粉酶酶活力测定 | 第40页 |
| 2.2.10 纳豆激酶酶活力测定 | 第40-41页 |
| 2.2.11 乙偶姻和丁二醇的检测方法 | 第41-42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-68页 |
| 3.1 B.licheniformis WX-02基因组测序 | 第42-46页 |
| 3.1.1 B.licheniformis WX-02基因组DNA的抽提 | 第42页 |
| 3.1.2 测序方案 | 第42-43页 |
| 3.1.3 测序结果注释 | 第43-46页 |
| 3.1.3.1 B.licheniformis WX-02基因组组分统计 | 第43页 |
| 3.1.3.2 Bacillus licheniformis WX-02基因组的蛋白酶和肽酶分析 | 第43-46页 |
| 3.2 用于表达外源蛋白的B. licheniformis WX-02的改造 | 第46-68页 |
| 3.2.1 敲除质粒的构建 | 第46-48页 |
| 3.2.2 胞外蛋白酶、a-淀粉酶和分泌蛋白Hag基因的敲除 | 第48-59页 |
| 3.2.2.1 缺失突变株B.lihcheniformis BL1的构建 | 第48-49页 |
| 3.2.2.2 缺失突变株B.lihcheniformis BL2的构建 | 第49-50页 |
| 3.2.2.3 缺失突变株B.lihcheniformis BL3的构建 | 第50-51页 |
| 3.2.2.4 缺失突变株B.lihcheniformis BL4的构建 | 第51-53页 |
| 3.2.2.5 缺失突变株B.lihcheniformis BL5的构建 | 第53页 |
| 3.2.2.6 缺失突变株B.lihcheniformis BL6的构建 | 第53-54页 |
| 3.2.2.7 缺失突变株B.lihchenformis BL7的构建 | 第54页 |
| 3.2.2.8 缺失突变株B.lihcheniformis BL8的构建 | 第54页 |
| 3.2.2.9 缺失突变株B.lihcheniformis BL9的构建 | 第54-56页 |
| 3.2.2.10 缺失突变株B.licheniformis BL10的构建 | 第56-58页 |
| 3.2.2.11 胞外蛋白酶缺失株发酵液特征 | 第58-59页 |
| 3.2.3 B.licheniformisα-淀粉酶的高效分泌表达实验 | 第59-64页 |
| 3.2.3.1 α-淀粉酶表达质粒pP43SAT的构建 | 第59-61页 |
| 3.2.3.2 α-淀粉酶在工程菌中高效分泌表达 | 第61-64页 |
| 3.2.4 纳豆激酶(NK)的高效分泌表达 | 第64-68页 |
| 3.2.4.1 纳豆激酶表达质粒pP43SNT的构建 | 第64-66页 |
| 3.2.4.2 纳豆激酶在工程菌中高效分泌表达 | 第66-68页 |
| 4 讨论与展望 | 第68-72页 |
| 4.1 讨论 | 第68-71页 |
| 4.2 展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 在读期间发表论文 | 第81页 |
