| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-21页 |
| 1 结冷胶研究进展 | 第9-21页 |
| 1.1 少动鞘氨醇单胞菌 | 第9页 |
| 1.2 结冷胶 | 第9-17页 |
| 1.2.1 概述 | 第9页 |
| 1.2.2 结冷胶的结构 | 第9-11页 |
| 1.2.3 结冷胶的理化性质 | 第11页 |
| 1.2.4 结冷胶的体内合成过程 | 第11-14页 |
| 1.2.5 结冷胶发酵的研究 | 第14-16页 |
| 1.2.6 结冷胶的应用 | 第16-17页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术的概述 | 第17-18页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9系统在细菌中的工作原理 | 第17-18页 |
| 1.4 透明颤菌血红蛋白 | 第18-19页 |
| 1.4.1 概述 | 第18页 |
| 1.4.2 透明颤菌血红蛋白（VHb）的结构 | 第18-19页 |
| 1.5 乙酰基转移酶（nat）基因 | 第19页 |
| 1.6 本文研究意义及内容 | 第19-21页 |
| 第二章 结冷胶生产菌株代谢工程改造 | 第21-54页 |
| 1 引言 | 第21页 |
| 2 实验材料 | 第21-26页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第21页 |
| 2.2 主要仪器设备 | 第21-22页 |
| 2.3 主要试剂 | 第22-23页 |
| 2.4 培养基 | 第23-24页 |
| 2.5 主要溶液的配制 | 第24-26页 |
| 3 实验方法及步骤 | 第26-35页 |
| 3.1 结冷胶生产菌株的培养 | 第26页 |
| 3.2 透明颤菌的培养 | 第26页 |
| 3.3 引物设计 | 第26页 |
| 3.4 菌株基因组DNA的提取 | 第26-27页 |
| 3.5 乙酰基转移酶基因（nat）的克隆 | 第27页 |
| 3.6 克隆基因片段的胶回收 | 第27页 |
| 3.7 感受态大肠杆菌的制备 | 第27页 |
| 3.8 p MD19-T-nat的构建 | 第27-28页 |
| 3.9 p EASY-Blunt Zero-nvn克隆载体的构建 | 第28-30页 |
| 3.9.1 乙酰基转移酶（nat）基因上下游同源臂的克隆 | 第28页 |
| 3.9.2 透明颤菌血红蛋白基因（vgb）的克隆 | 第28页 |
| 3.9.3 一步重叠PCR | 第28-30页 |
| 3.9.4 克隆载体p EASY-Blunt Zero-nvn的构建 | 第30页 |
| 3.10 表达载体p Target F-New-vgb的构建 | 第30-31页 |
| 3.11 少动鞘氨醇单胞菌JLJ感受态细胞的制备 | 第31页 |
| 3.12 电转化少动鞘氨醇单胞菌JLJ | 第31页 |
| 3.13 重组菌株JLJ-vgb中质粒的消除 | 第31-32页 |
| 3.14 重组菌株JLJ-vgb的鉴定 | 第32页 |
| 3.14.1 PCR鉴定 | 第32页 |
| 3.14.2 SDS-PAGE分析 | 第32页 |
| 3.14.3 VHb活性的测定——CO差光谱法 | 第32页 |
| 3.14.4 重组菌株的传代培养 | 第32页 |
| 3.14.5 重组菌株稳定性检测 | 第32页 |
| 3.15 结冷胶产量的测定 | 第32-33页 |
| 3.16 发酵培养基中生物量的测定 | 第33页 |
| 3.17 重组菌株发酵培养基及发酵工艺的优化 | 第33-35页 |
| 3.17.1 单因素实验 | 第33页 |
| 3.17.2 响应面法优化实验 | 第33-35页 |
| 4 结果与分析 | 第35-53页 |
| 4.1 结冷胶生产菌株的改造 | 第35-44页 |
| 4.1.1 基因敲入靶位点的克隆 | 第35-36页 |
| 4.1.2 pEASY-Blunt Zero-nvn克隆载体的构建 | 第36-39页 |
| 4.1.2.1 乙酰基转移酶（nat）基因上下游同源臂的克隆 | 第36页 |
| 4.1.2.2 vgb基因的克隆 | 第36-37页 |
| 4.1.2.3 一步重叠PCR | 第37-39页 |
| 4.1.3 表达载体p arget F-New-vgb的构建 | 第39-41页 |
| 4.1.4 重组菌株JLJ-vgb的获得及鉴定 | 第41-44页 |
| 4.1.4.1 PCR鉴定 | 第42页 |
| 4.1.4.2 SDS-PAGE分析 | 第42-43页 |
| 4.1.4.3 VHb蛋白活性的检测 | 第43-44页 |
| 4.1.4.4 重组菌株JLJ-vgb稳定性分析 | 第44页 |
| 4.2 重组菌株JLJ-vgb发酵培养基及发酵工艺的优化 | 第44-53页 |
| 4.2.1 碳源种类及浓度的优化 | 第45页 |
| 4.2.2 氮源种类及浓度的优化 | 第45-46页 |
| 4.2.3 发酵条件的优化 | 第46-47页 |
| 4.2.4 响应面法优化实验 | 第47-53页 |
| 4.2.4.1 响应面法实验设计及模型建立 | 第47-49页 |
| 4.2.4.2 模型 3D及等高线分析 | 第49-52页 |
| 4.2.4.3 模型的验证 | 第52-53页 |
| 5 结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 附录一 乙酰基转移酶基因序列 | 第59-60页 |
| 附录二 pEASY-Blunt Zero-nvn部分基因序列 | 第60-61页 |
| 附录三 pTarget F-New反向PCR部分基因序列 | 第61-62页 |
| 附录四 pTarget F-New-vgb表达载体部分基因序列 | 第62-63页 |
| 附录五 重组菌株JLJ-vgb vgb基因序列 | 第63页 |
