| 中文摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 缩略语/符号说明 | 第12-16页 |
| 前言 | 第16-19页 |
| 研究现状、成果 | 第16-18页 |
| 研究目的、方法 | 第18-19页 |
| 一、hTERT启动子调控腺相关病毒介导PE38KEDL基因载体的构建及其鉴定 | 第19-59页 |
| 1.1 对象和方法 | 第19-34页 |
| 1.1.1 主要实验仪器 | 第19页 |
| 1.1.2 主要试剂及试剂盒 | 第19页 |
| 1.1.3 质粒 | 第19-21页 |
| 1.1.4 细菌 | 第21页 |
| 1.1.5 细胞 | 第21页 |
| 1.1.6 主要实验试剂及缓冲液的配制 | 第21页 |
| 1.1.7 质粒的转化 | 第21页 |
| 1.1.8 质粒的扩增和小量提取 | 第21-22页 |
| 1.1.9 质粒的扩增和大量提取 | 第22-23页 |
| 1.1.10 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第23页 |
| 1.1.11 质粒浓度及纯度的测定 | 第23页 |
| 1.1.12 菌种的冻存方法 | 第23页 |
| 1.1.13 基因组DNA的提取 | 第23-24页 |
| 1.1.14 人hTERT启动子的扩增 | 第24-25页 |
| 1.1.15 PCR产物的检测 | 第25页 |
| 1.1.16 hTERT 启动子 PCR 产物的回收 | 第25-26页 |
| 1.1.17 人hTERTl启动子和pAAV-hrGFP的Mhi I酶切位点的酶切 | 第26页 |
| 1.1.18 人hTERT启动子和pAAV-hrGFP Mlu I酶切产物的回收 | 第26页 |
| 1.1.19 pAAV-hrGFPMlu I酶切回收产物的去磷酸化 | 第26-27页 |
| 1.1.20 人hTERT启动子1与pAAV-hrGFP单克隆位点的连接 | 第27页 |
| 1.1.21 连接产物的酶切和测序鉴定 | 第27-28页 |
| 1.1.22 质粒pAAV-hTERT-hrGFP的Xba I和Mim I酶切位点的双酶切 | 第28页 |
| 1.1.23 质粒pAAV-hTERT-hrGFP的双酶切产物的回收 | 第28页 |
| 1.1.24 载体质粒pAAV-hTERT-hrGFP和PE38KEDL基因片段的连接 | 第28页 |
| 1.1.25 PE38KEDL基因片段的合成 | 第28-29页 |
| 1.1.26 质粒 PE38KEDL-pUC18 小量扩增 | 第29页 |
| 1.1.27 Xba I 和 MunI 双酶切 PE38KEDL-PUC18 得到 PE38KDEL | 第29页 |
| 1.1.28 载体质粒pAAV-hTERT-hrGFP和PE38KEDL基因片段的连接 | 第29页 |
| 1.1.29 pAAV-hTERT-PE38KEL-hrGFP 酶切和测序鉴定 | 第29-30页 |
| 1.1.30 三质粒共转染HEK293细胞包装重组腺相关病毒 | 第30-31页 |
| 1.1.31 腺相关病毒的收集和纯化 | 第31页 |
| 1.1.32 AVSachTMELISA法测定腺相关病毒颗粒滴度 | 第31-32页 |
| 1.1.33 腺相关病毒纯度的检测 | 第32-34页 |
| 1.1.34 腺相关病毒的电镜观察 | 第34页 |
| 1.1.35 腺相关病毒转染MiaPaCa2人胰腺癌细胞及WI-38人胚肺成纤维细胞 | 第34页 |
| 1.2 结果 | 第34-48页 |
| 1.2.1 质粒转化DH5 a感受态细胞后的小提质粒结果 | 第34-35页 |
| 1.2.2 人基因组DNA的提取结果 | 第35页 |
| 1.2.3 人hTERT启动子的扩增 | 第35-36页 |
| 1.2.4 质粒pAAV-hrGFP经Mlu I酶切电泳结果 | 第36页 |
| 1.2.5 质粒pAAV-hTERT-hrGFP的构建和鉴定 | 第36-42页 |
| 1.2.6 质粒 pAAV-hTERT-PE38KEL-hrGFP 的构建和鉴定 | 第42-46页 |
| 1.2.7 重组腺相关病毒在HEK293细胞中的包装 | 第46-47页 |
| 1.2.8 重组腺相关病毒的收集纯化鉴定 | 第47页 |
| 1.2.9 腺相关病毒的滴度测定及电镜观测 | 第47-48页 |
| 1.2.10 rAAV 转染 MiaPaCa2 及 WI-38 细胞 | 第48页 |
| 1.3 讨论 | 第48-58页 |
| 1.3.1 肿瘤基因治疗现状 | 第48-49页 |
| 1.3.2 端粒酶在基因治疗中的应用 | 第49-51页 |
| 1.3.3 铜绿假单胞菌外毒素在肿瘤治疗中的应用 | 第51-54页 |
| 1.3.4 腺相关病毒在肿瘤治疗中的应用 | 第54-57页 |
| 1.3.5 本课题的设计思路 | 第57-58页 |
| 1.4 小结 | 第58-59页 |
| 二、pAAV-hTERT-PE83KEL-hrGFP病毒载体对MiaPaCa2细胞凋亡的影响 | 第59-78页 |
| 前言 | 第59页 |
| 2.1 对象和方法 | 第59-69页 |
| 2.1.1 主要试验仪器 | 第59-60页 |
| 2.1.2 主要实验材料 | 第60页 |
| 2.1.3 细胞 | 第60页 |
| 2.1.4 主要实验试剂及缓冲液的配制 | 第60-63页 |
| 2.1.5 细胞培养及实验分组 | 第63-64页 |
| 2.1.6 H亮氨酸掺入法测定AAV-hTERT-PE38KDEL对人胰腺癌细胞蛋白合成的的影响 | 第64页 |
| 2.1.8 噻唑兰（MTT)比色法测定胰腺癌细胞MiaPaC2的增殖活性 | 第64-65页 |
| 2.1.9 DNA片段分析 | 第65页 |
| 2.1.10 细胞总蛋白的提取 | 第65页 |
| 2.1.11 BGA法蛋白定量 | 第65-67页 |
| 2.1.12 蛋白的免疫学检测 | 第67-68页 |
| 2.1.13 原位凋亡检测 | 第68-69页 |
| 2.1.14 统计学分析 | 第69页 |
| 2.2 结果 | 第69-73页 |
| 2.2.1 MiaPaCa2人胰腺癌细胞的生长情况 | 第69页 |
| 2.2.2 病毒对MiaPaCa2细胞蛋白合成的抑制作用 | 第69-70页 |
| 2.2.3 MTT比色法测定MiaPaC2人胰腺癌细胞的增殖活性 | 第70页 |
| 2.2.4 TUNEL法检测MiaPaC2细胞凋亡的情况 | 第70-72页 |
| 2.2.5 考马斯亮蓝染色观察 | 第72页 |
| 2.2.6 rAAV-hTERT-PE38KDEL 病毒对 MiaPaC2 人胰腺癌细胞 caspase-3，-8，-9以及抗凋亡蛋白家族蛋白表达的影响 | 第72-73页 |
| 2.3 讨论 | 第73-77页 |
| 2.3.1 hTERT启动子在肿瘤靶向基因治疗中的应用 | 第73-74页 |
| 2.3.2 基于PE的免疫毒素在肿瘤治疗中的应用 | 第74-76页 |
| 2.3.3 细胞凋亡与肿瘤 | 第76-77页 |
| 2.4 小结 | 第77-78页 |
| 三、rAAV-hTERT-PE8DKE治疗胰腺癌荷瘤裸鼠的实验研究 | 第78-89页 |
| 前言 | 第78-79页 |
| 3.1 材料 | 第79-83页 |
| 3.1.1 主要试剂和实验仪器 | 第79页 |
| 3.1.2 动物 | 第79页 |
| 3.1.3 裸鼠肿瘤移植模型的建立 | 第79页 |
| 3.1.4 实验分组 | 第79-80页 |
| 3.1.5 TUNEL检测肿瘤组织原位凋亡 | 第80-81页 |
| 3.1.6 组织标本的常规苏木精-伊红（HE)染色 | 第81页 |
| 3.1.7 细胞总RNA的提取 | 第81页 |
| 3.1.8 RNA完整性的检测（甲醛变性凝胶电泳） | 第81-82页 |
| 3.1.9 RT-PCR检测PE38KDEL的表达 | 第82页 |
| 3.1.10 统计学分析 | 第82-83页 |
| 3.2 结果 | 第83-86页 |
| 3.2.1 不同组别的裸鼠荷瘤生长情 | 第83-84页 |
| 3.2.2 不同组别的裸鼠移植瘤组织病理学变化 | 第84页 |
| 3.2.3 TUNEL原位凋亡试剂盒检测不同组别细胞凋亡情况 | 第84-85页 |
| 3.2.4 细胞总RNA的提取及电泳结果 | 第85页 |
| 3.2.5 RT-PCR 扩增 PE38KDEL 片段 | 第85-86页 |
| 3.3 讨论 | 第86-88页 |
| 3.3.1 肿瘤移植模型在肿瘤研究中的作用 | 第86页 |
| 3.3.2 腺相关病毒作为载体在肿瘤研究中的作用 | 第86-88页 |
| 3.4 小结 | 第88-89页 |
| 全文结论 | 第89-90页 |
| 论文创新点 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-95页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第95-96页 |
| 综述 胰腺癌的靶向治疗进展 | 第96-110页 |
| 参考文献 | 第103-110页 |
| 致谢 | 第110页 |
