| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 英文缩写表 | 第11-13页 |
| 1 引言 | 第13-25页 |
| 1.1 大肠杆菌的耐药现状 | 第13-16页 |
| 1.1.1 大肠杆菌的耐药机制 | 第14-15页 |
| 1.1.2 大肠杆菌外膜蛋白的特点 | 第15页 |
| 1.1.3 大肠杆菌外膜蛋白与抗生素耐药机制 | 第15-16页 |
| 1.2 外膜蛋白 OmpF 与β-内酰胺类抗生素耐药性关系 | 第16-19页 |
| 1.2.1 外膜蛋白 OmpF 结构 | 第16-17页 |
| 1.2.2 β-内酰胺类抗生素作用机制 | 第17-18页 |
| 1.2.3 影响β-内酰胺类抗菌作用因素 | 第18页 |
| 1.2.4 大肠杆菌外膜蛋白 OmpF 结构与β-内酰胺类抗生素作用的关系 | 第18-19页 |
| 1.3 检测耐药性方法及原理 | 第19-20页 |
| 1.3.1 定性测定纸片扩散法 | 第19页 |
| 1.3.2 定量肉汤稀释法 | 第19-20页 |
| 1.4 Red 重组技术 | 第20-22页 |
| 1.4.1 传统的重组敲除技术 | 第20页 |
| 1.4.2 Red 重组技术 | 第20页 |
| 1.4.3 Red 重组技术的原理 | 第20-21页 |
| 1.4.4 Red 重组技术的主要步骤 | 第21-22页 |
| 1.5 研究的目的意义 | 第22-24页 |
| 1.6 技术路线 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-45页 |
| 2.1 材料 | 第25-29页 |
| 2.1.1 质粒与菌株 | 第25页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第25页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 2.1.4 主要试剂配制 | 第26-29页 |
| 2.2 方法 | 第29-40页 |
| 2.2.1 目的大肠杆菌菌株的筛选 | 第29页 |
| 2.2.2 阳性菌株 OmpF 基因的克隆测序 | 第29-31页 |
| 2.2.3 工具质粒的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.4 打靶 DNA 片段的制备 | 第32-35页 |
| 2.2.5 大肠杆菌 F-M-2 缺失株的构建 | 第35-40页 |
| 2.3 大肠杆菌 OmpF 缺失株的鉴定 | 第40-43页 |
| 2.3.1 用 PCR 检测大肠杆菌 OmpF 缺失株 | 第40-41页 |
| 2.3.2 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳检测大肠杆菌 OmpF 缺失株 | 第41-43页 |
| 2.4 大肠杆菌缺失株与亲本株生长曲线的测定 | 第43页 |
| 2.4.1 大肠杆菌亲本株与基因缺失株的接种 | 第43页 |
| 2.4.2 菌液 OD600值的测定 | 第43页 |
| 2.5 亲本株与缺失株药敏试验 | 第43-44页 |
| 2.6 亲本株与缺失株对β-内酰胺类 MIC 值的测定 | 第44-45页 |
| 3 实验结果 | 第45-62页 |
| 3.1 目的大肠杆菌菌株筛选结果 | 第45-46页 |
| 3.2 阳性菌株 F-M-2/OmpF 基因的克隆测序结果 | 第46-47页 |
| 3.3 序列同源性比较结果 | 第47-48页 |
| 3.4 OmpF 蛋白预测分析 | 第48-51页 |
| 3.4.1 OmpF 蛋白质疏水性分析 | 第48-49页 |
| 3.4.2 OmpF 蛋白质二级结构 | 第49-50页 |
| 3.4.3 OmpF 蛋白质三级结构 | 第50-51页 |
| 3.5 基因敲除结果 | 第51-57页 |
| 3.5.1 工具质粒 pKD3、pKD46、pCP20 的提取 | 第51-52页 |
| 3.5.2 打靶片段的制备结果 | 第52页 |
| 3.5.3 质粒 pkd46 转化 F-M-2 的鉴定结果 | 第52-53页 |
| 3.5.4 打靶片段与基因 OmpF 同源重组的鉴定 | 第53-54页 |
| 3.5.5 转化 pCP20 重组结果 | 第54-55页 |
| 3.5.6 氯霉素抗性基因的消除鉴定 | 第55-56页 |
| 3.5.7 亲本株和缺失株蛋白 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳检测结果 | 第56-57页 |
| 3.6 亲本株与缺失株生长曲线的测定结果与分析： | 第57-58页 |
| 3.7 大肠杆菌亲本株和缺失株对几种抗生素的耐药性 | 第58-62页 |
| 3.7.1 亲本株与缺失株药敏试验结果 | 第58-60页 |
| 3.7.2 亲本株与缺失株 MIC 试验结果 | 第60-62页 |
| 4 讨论 | 第62-66页 |
| 4.1 OmpF 基因敲除与 Red 重组 | 第62-63页 |
| 4.2 OmpF 基因缺失对菌株生长的影响 | 第63-64页 |
| 4.3 OmpF 基因与抗生素对细菌的作用时间 | 第64页 |
| 4.4 OmpF 基因缺失与β-内酰胺类抗生素耐药性 | 第64-66页 |
| 5 结论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 附录 | 第72-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
