| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第11-13页 |
| 1. 前言 | 第13-21页 |
| 1.1 研究问题的由来 | 第13页 |
| 1.2 文献综述 | 第13-20页 |
| 1.2.1 牛传染性鼻气管炎 | 第13-18页 |
| 1.2.2 GM-CSF基因佐剂 | 第18-20页 |
| 1.3 研究目的 | 第20-21页 |
| 2. 材料与方法 | 第21-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-26页 |
| 2.1.1 细胞株与病毒株 | 第21页 |
| 2.1.2 载体与质粒 | 第21页 |
| 2.1.3 质粒构建所需材料及试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.4 细胞培养、病毒筛选等试剂及其配制 | 第22-23页 |
| 2.1.5 SDS-PAGE所需试剂及其配制 | 第23-24页 |
| 2.1.6 Western blot所需材料 | 第24页 |
| 2.1.7 ELISA缓冲液 | 第24页 |
| 2.1.8 提取包涵体的相关溶液 | 第24-25页 |
| 2.1.9 其他试剂 | 第25页 |
| 2.1.10 实验动物 | 第25页 |
| 2.1.11 主要仪器 | 第25页 |
| 2.1.12 分子生物学分析软件与统计学分析方法 | 第25-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-37页 |
| 2.2.1. pET-32a-GM-CSF原核表达载体的构建 | 第26-27页 |
| 2.2.2 牛GM-CSF基因的原核表达 | 第27-28页 |
| 2.2.3 牛GM-CSF多克隆抗体的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.4 真核表达牛GM-CSF蛋白 | 第29-30页 |
| 2.2.5 转移载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.6 病毒基因组DNA的制备 | 第31-33页 |
| 2.2.7 转移载体与亲本病毒基因组DNA的共转染 | 第33页 |
| 2.2.8 重组病毒的筛选 | 第33-34页 |
| 2.2.9 重组病毒的生物学特征 | 第34页 |
| 2.2.10 重组病毒的鉴定 | 第34-35页 |
| 2.2.11 重组病毒在兔体内的免疫原性研究 | 第35-37页 |
| 2.3 本实验中所用引物 | 第37-38页 |
| 3. 结果与分析 | 第38-54页 |
| 3.1 原核表达牛GM-CSF蛋白及纯化 | 第38-39页 |
| 3.2 牛GM-CSF多克隆抗体的制备 | 第39-40页 |
| 3.2.1 牛GM-CSF重组蛋白的反应原性检测 | 第39页 |
| 3.2.2 多克隆抗体效价检测 | 第39-40页 |
| 3.3 GM-CSF基因真核表达产物的Western blot检测 | 第40-41页 |
| 3.4 转移载体的鉴定 | 第41-42页 |
| 3.5 BHV-1 gG~-/TK~-/EGFP~+病毒基因组的鉴定 | 第42-43页 |
| 3.6 重组病毒的筛选与纯化 | 第43-44页 |
| 3.7 重组病毒的鉴定 | 第44-46页 |
| 3.7.1 重组病毒的PCR鉴定 | 第44页 |
| 3.7.2 重组病毒RT-PCR验证 | 第44-46页 |
| 3.7.3 重组病毒Western blot验证 | 第46页 |
| 3.8 重组病毒生物学特征 | 第46-49页 |
| 3.8.1 重组病毒毒价的测定 | 第46-47页 |
| 3.8.2 重组病毒空斑大小比较 | 第47页 |
| 3.8.3 重组病毒连续传代PCR检测 | 第47-48页 |
| 3.8.4 一步法生长曲线的测定 | 第48-49页 |
| 3.9 重组病毒在兔体内免疫效果 | 第49-54页 |
| 3.9.1 日本大耳白兔免疫后临床症状的观察 | 第49-50页 |
| 3.9.2 接种后鼻拭子病毒分离检测 | 第50页 |
| 3.9.3 中和抗体的检测 | 第50-51页 |
| 3.9.4 血清中BHV-1 ELISA抗体的检测 | 第51页 |
| 3.9.5 免疫后细胞因子的检测 | 第51-52页 |
| 3.9.6 攻毒后临床症状的观察 | 第52-53页 |
| 3.9.7 攻毒后鼻拭子病毒分离检测 | 第53-54页 |
| 4. 讨论与结论 | 第54-59页 |
| 4.1 讨论 | 第54-58页 |
| 4.1.1 牛GM-CSF蛋白在原核表达载体,真核表达载体和重组病毒载体的表达 | 第54-55页 |
| 4.1.2 重组病毒BHV-1 gG~-/TK~-/GM-CSF~+在兔体内免疫原性的研究 | 第55-56页 |
| 4.1.3 重组病毒BHV-1 gG~-/TK~-/GM-CSF~+的生物学特性 | 第56页 |
| 4.1.4 转染方法的选择与技术要点 | 第56-58页 |
| 4.2 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
