| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第7-12页 |
| 1.1 生物药物 | 第7-8页 |
| 1.1.1 生物药物蛋白简介 | 第7页 |
| 1.1.2 生物药物蛋白目前的问题与解决方案 | 第7-8页 |
| 1.2 高尔基体内N-糖代谢途径与溶酶体贮积症 | 第8-11页 |
| 1.2.1 高尔基体内N-糖代谢途径 | 第8-9页 |
| 1.2.2 糖苷水解酶家族 47（GH47） | 第9-10页 |
| 1.2.3 溶酶体与溶酶体贮积症 | 第10-11页 |
| 1.3 本论文研究意义和主要内容 | 第11-12页 |
| 1.3.1 本论文研究意义 | 第11页 |
| 1.3.2 本论文主要研究内容 | 第11-12页 |
| 第二章 材料与方法 | 第12-30页 |
| 2.1 实验材料 | 第12-18页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第12-13页 |
| 2.1.2 试剂、酶及耗材 | 第13-15页 |
| 2.1.3 培养基 | 第15页 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 | 第15-17页 |
| 2.1.5 主要设备与仪器 | 第17-18页 |
| 2.2 实验方法 | 第18-30页 |
| 2.2.1 大肠杆菌XL-10 Gold感受态细胞的制备 | 第18页 |
| 2.2.2 pME-HF-LIPA/pME-HF-GLA重组蛋白表达质粒的构建 | 第18-20页 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建 | 第20-21页 |
| 2.2.4 哺乳动物细胞培养 | 第21页 |
| 2.2.5 CRISPR/Cas9系统基因敲除质粒的转染 | 第21页 |
| 2.2.6 有限稀释法（limiting dilution cloning，LDC）分离单克隆细胞株 | 第21页 |
| 2.2.7 单克隆细胞的获取与验证 | 第21-22页 |
| 2.2.8 甘露糖苷酶在HEK293细胞中转录mRNA的验证 | 第22-23页 |
| 2.2.9 逆转录病毒介导的细胞稳定转染 | 第23页 |
| 2.2.10 流式细胞分析 | 第23-24页 |
| 2.2.11 蛋白质印迹法 | 第24-26页 |
| 2.2.12 重组抗体的纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.13 BCA试剂盒测定蛋白浓度 | 第27页 |
| 2.2.14 全细胞糖链的质谱测定 | 第27-29页 |
| 2.2.15 α1,2-甘露糖苷酶抑制剂Kifunesine处理 | 第29-30页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第30-46页 |
| 3.1 α1,2-甘露糖苷酶相关基因的敲除 | 第30-40页 |
| 3.1.1 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除高尔基体 α1,2-甘露糖苷酶Ⅰ基因 | 第30-31页 |
| 3.1.2 构建 α1,2-甘露糖苷酶Ⅰ基因双敲除细胞株D-KO | 第31-33页 |
| 3.1.3 通过流式分析对双敲除细胞表面N-糖链结构变化进行比较 | 第33-34页 |
| 3.1.4 野生型细胞WT、双敲除细胞D-KO的生长情况的测定 | 第34-35页 |
| 3.1.5 其他与 α1,2-甘露糖苷酶相关的基因 | 第35-38页 |
| 3.1.6 构建MAN1A1、MAN1A2和MAN1B1三基因敲除的细胞株 | 第38-40页 |
| 3.2 对构建的细胞株进行糖链的测定 | 第40-46页 |
| 3.2.1 对WT、D-KO和T-KO细胞进行全细胞糖链分析 | 第40-41页 |
| 3.2.2 Western blotting分析糖链变化和类型区分 | 第41-42页 |
| 3.2.3 Western blotting分析LAMP2糖链变化和类型区分 | 第42-44页 |
| 3.2.4 重组蛋白EGFP-FLAG-HyHEL10的纯化 | 第44页 |
| 3.2.5 重组蛋白EGFP-FLAG-HyHEL10的糖链结构 | 第44-46页 |
| 主要结论与展望 | 第46-48页 |
| 主要结论 | 第46页 |
| 展望 | 第46-48页 |
| 致谢 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-52页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的文章 | 第52页 |
