| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-10页 |
| 英文缩略表 | 第16-17页 |
| 第一章 引言 | 第17-24页 |
| 1.1 酵母双杂交技术 | 第17-19页 |
| 1.1.1 酵母双杂交技术的原理 | 第17页 |
| 1.1.2 酵母双杂交技术的优势 | 第17-18页 |
| 1.1.3 酵母双杂交技术的局限性 | 第18-19页 |
| 1.1.4 酵母双杂交在顶复器原虫研究中的应用 | 第19页 |
| 1.2 噬菌体展示技术 | 第19-20页 |
| 1.2.1 噬菌体展示技术的原理 | 第19页 |
| 1.2.2 噬菌体展示技术的优势及特点 | 第19-20页 |
| 1.2.3 噬菌体展示技术的局限 | 第20页 |
| 1.2.4 噬菌体展示技术在蛋白互作中的应用 | 第20页 |
| 1.3 免疫共沉淀技术 | 第20-21页 |
| 1.3.1 免疫共沉淀原理 | 第20页 |
| 1.3.2 免疫共沉淀的优势 | 第20-21页 |
| 1.3.3 免疫共沉淀的局限性 | 第21页 |
| 1.3.4 免疫共沉淀的应用 | 第21页 |
| 1.4 双分子荧光互补技术 | 第21-22页 |
| 1.4.1 双分子荧光互补的原理 | 第21-22页 |
| 1.4.2 双分子荧光互补的优势以及局限性 | 第22页 |
| 1.4.3 双分子荧光互补技术的应用 | 第22页 |
| 1.5 展望 | 第22-24页 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建 | 第24-33页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 材料与方法 | 第24-29页 |
| 2.2.1 实验动物 | 第24-25页 |
| 2.2.2 实验虫株 | 第25页 |
| 2.2.3 实验试剂 | 第25页 |
| 2.2.4 主要实验仪器 | 第25-26页 |
| 2.2.5 引物设计 | 第26页 |
| 2.2.6 柔嫩艾美耳球虫子孢子的收集与纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.7 柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA的提取 | 第27页 |
| 2.2.8 第一链的合成 | 第27页 |
| 2.2.9 双链的合成及纯化 | 第27页 |
| 2.2.10 酵母感受态的制备及文库的构建 | 第27-28页 |
| 2.2.11 文库质量的鉴定 | 第28页 |
| 2.2.12 用柔嫩艾美耳球虫特异性引物从文库中钓取基因 | 第28-29页 |
| 2.3 结果 | 第29-31页 |
| 2.3.1 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊及子孢子的纯化 | 第29页 |
| 2.3.2 子孢子总RNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.3.3 双链cDNA的扩增及纯化 | 第30页 |
| 2.3.4 文库质量的鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3.5 特异性引物扩增获得球虫基因 | 第31页 |
| 2.4 讨论 | 第31-33页 |
| 第三章 诱饵载体pGBKT7-EtCDPK3的构建以及互作蛋白的筛选 | 第33-45页 |
| 3.1 引言 | 第33-34页 |
| 3.2 材料与方法 | 第34-38页 |
| 3.2.1 菌株 | 第34页 |
| 3.2.2 试剂 | 第34页 |
| 3.2.3 主要试剂的配置 | 第34页 |
| 3.2.4 诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK3的构建 | 第34-36页 |
| 3.2.5 诱饵菌株的制备与鉴定 | 第36-37页 |
| 3.2.6 重组质粒pGBKT7-EtCDPK3互作蛋白的筛选 | 第37-38页 |
| 3.2.7 阳性克隆插入片段的鉴定 | 第38页 |
| 3.2.8 阳性克隆质粒的提取与纯化 | 第38页 |
| 3.3 结果 | 第38-43页 |
| 3.3.1 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK3的构建 | 第38-39页 |
| 3.3.2 诱饵菌株的构建 | 第39页 |
| 3.3.3 pGBKT7-EtCDPK3自转录活性检测 | 第39-40页 |
| 3.3.4 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK3对酵母细胞毒性的检测 | 第40-41页 |
| 3.3.5 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK3蛋白在酵母菌中表达检测 | 第41页 |
| 3.3.6 互作蛋白的初步筛选 | 第41-42页 |
| 3.3.7 PCR扩增阳性克隆中cDNA插入片段 | 第42页 |
| 3.3.8 插入片段质粒的提取与鉴定 | 第42-43页 |
| 3.4 讨论 | 第43-45页 |
| 第四章 诱饵蛋白EtCDPK3与阳性克隆蛋白互作的验证 | 第45-57页 |
| 4.1 引言 | 第45页 |
| 4.2 材料与方法 | 第45-49页 |
| 4.2.1 主要试剂 | 第45-46页 |
| 4.2.2 主要实验仪器 | 第46页 |
| 4.2.3 回复杂交 | 第46页 |
| 4.2.4 Et12、Et14、Et27基因的克隆 | 第46-47页 |
| 4.2.5 双分子荧光互补实验(BiFC) | 第47-48页 |
| 4.2.6 间接免疫荧光鉴定真核质粒在DF-1 中的表达情况 | 第48页 |
| 4.2.7 Western blot鉴定重组真核质粒在DF-1 细胞中的表达鉴定 | 第48页 |
| 4.2.8 免疫共沉淀互作的验证 | 第48-49页 |
| 4.3 结果 | 第49-55页 |
| 4.3.1 回复杂交验证 | 第49页 |
| 4.3.2 BiFC真核重组质粒的构建 | 第49-50页 |
| 4.3.3 BiFC检测蛋白的互作 | 第50-51页 |
| 4.3.4 Co-IP实验真核重组质粒的构建 | 第51-52页 |
| 4.3.5 间接免疫荧光鉴定重组质粒在DF-1 细胞中的表达情况 | 第52-53页 |
| 4.3.6 Western blot鉴定重组质粒在DF-1 细胞中的表达情况 | 第53-54页 |
| 4.3.7 免疫共沉淀结果 | 第54-55页 |
| 4.4 讨论 | 第55-57页 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP12功能初步分析 | 第57-68页 |
| 5.1 引言 | 第57页 |
| 5.2 材料与方法 | 第57-60页 |
| 5.2.1 实验动物 | 第57页 |
| 5.2.2 所用载体及细胞 | 第57页 |
| 5.2.3 主要实验试剂 | 第57-58页 |
| 5.2.4 EtCHP12基因的克隆和序列分析 | 第58页 |
| 5.2.5 重组表达质粒pET-28a-Et CHP12的构建与鉴定 | 第58页 |
| 5.2.6 重组质粒pET-28a-Et CHP12的表达与鉴定 | 第58-59页 |
| 5.2.7 重组蛋白His-EtCHP12亲和层析纯化 | 第59页 |
| 5.2.8 重组蛋白多克隆抗体的制备与纯化 | 第59页 |
| 5.2.9 pET-28a-Et CHP12重组蛋白免疫原性和反应原性分析 | 第59页 |
| 5.2.10 抗rEtCHP12多克隆抗体体外抑制分析 | 第59-60页 |
| 5.3 结果 | 第60-66页 |
| 5.3.1 柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP12基因的扩增 | 第60页 |
| 5.3.2 蛋白EtCHP12基因序列生物信息学分析 | 第60-62页 |
| 5.3.3 重组质粒pET-28a-Et CHP12的构建与鉴定 | 第62页 |
| 5.3.4 原核重组蛋白的表达及存在形式 | 第62-63页 |
| 5.3.5 原核重组蛋白的纯化 | 第63-64页 |
| 5.3.6 多克隆抗体的制备与纯化 | 第64-65页 |
| 5.3.7 重组蛋白免疫原性和反应原性分析 | 第65页 |
| 5.3.8 体外抑制实验结果 | 第65-66页 |
| 5.4 讨论 | 第66-68页 |
| 第六章 全文总结 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 作者简历 | 第75页 |
