极耐热性β-葡萄糖苷酶的高效表达及其在生产栀子蓝色素中的应用
| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 综述 | 第9-16页 |
| 1 食用天然色素 | 第9-10页 |
| 1.1 食用天然色素的发展 | 第9页 |
| 1.2 食用天然色素现状 | 第9-10页 |
| 1.3 食用天然色素的发展方针与展望 | 第10页 |
| 2 栀子 | 第10-14页 |
| 2.1 栀子简介 | 第10-11页 |
| 2.2 栀子系列色素 | 第11页 |
| 2.3 栀子黄色素 | 第11-12页 |
| 2.4 栀子蓝色素 | 第12页 |
| 2.5 天然蓝色素的来源 | 第12页 |
| 2.6 栀子蓝色素的呈色机理 | 第12-13页 |
| 2.7 栀子蓝色素的理化性质 | 第13-14页 |
| 3 研究背景与研究内容 | 第14-16页 |
| 3.1 研究背景 | 第14页 |
| 3.2 研究内容 | 第14-16页 |
| 第二章 材料与方法 | 第16-32页 |
| 2.1 材料 | 第16-20页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第16页 |
| 2.1.2 培养基配方 | 第16-18页 |
| 2.1.3 主要试剂及其来源 | 第18-19页 |
| 2.1.4 主要仪器设备及其来源 | 第19-20页 |
| 2.1.5 DNA引物合成和DNA测序服务 | 第20页 |
| 2.2 方法 | 第20-32页 |
| 2.2.1 海栖热袍菌的培养 | 第20-21页 |
| 2.2.2 海栖热袍菌基因组DNA的提取 | 第21页 |
| 2.2.3 感受态细胞的制备 | 第21-22页 |
| 2.2.4 电转化 | 第22页 |
| 2.2.5 胶回收DNA片断 | 第22页 |
| 2.2.6 酶切、连接、磷酸化反应及乙醇沉淀 | 第22页 |
| 2.2.7 质粒抽提 | 第22-23页 |
| 2.2.8 重组β-葡萄糖苷酶的构建 | 第23页 |
| 2.2.8.1 引物设计 | 第23页 |
| 2.2.8.2 基因扩增 | 第23页 |
| 2.2.8.3 质粒构建与酶切验证 | 第23页 |
| 2.2.9 重组质粒二级结构的优化 | 第23-24页 |
| 2.2.9.1 引物设计 | 第23-24页 |
| 2.2.9.2 PCR扩增 | 第24页 |
| 2.2.9.3 质粒构建与验证 | 第24页 |
| 2.2.10 重组菌的诱导表达 | 第24-25页 |
| 2.2.10.1 诱导时机 | 第25页 |
| 2.2.10.2 诱导时间 | 第25页 |
| 2.2.11 中试放大生产重组蛋白 | 第25-26页 |
| 2.2.11.1 菌种的准备 | 第25页 |
| 2.2.11.2 设备的使用 | 第25-26页 |
| 2.2.11.2.1 NB型空气过滤器消毒 | 第25-26页 |
| 2.2.11.2.2 设备空消 | 第26页 |
| 2.2.11.2.3 培养基实消 | 第26页 |
| 2.2.11.3 发酵生产 | 第26页 |
| 2.2.12 重组质粒在不同宿主细胞中的表达 | 第26-27页 |
| 2.2.13 酶活的测定 | 第27页 |
| 2.2.14 重组蛋白的纯化 | 第27-28页 |
| 2.2.14.1 粗酶液的制备 | 第27-28页 |
| 2.2.14.2 热处理 | 第28页 |
| 2.2.14.3 阴离子交换层析柱 | 第28页 |
| 2.2.14.4 硫酸铵沉淀 | 第28页 |
| 2.2.14.5 透析 | 第28页 |
| 2.2.15 蛋白浓度的测定 | 第28-29页 |
| 2.2.15.1 试剂配方 | 第28-29页 |
| 2.2.15.2 制作标准曲线 | 第29页 |
| 2.2.16 SDS-PAGE | 第29-30页 |
| 2.2.16.1 溶液配制 | 第29-30页 |
| 2.2.16.2 胶的制作 | 第30页 |
| 2.2.17 栀子蓝色素的转化 | 第30-32页 |
| 2.2.17.1 底物栀子苷的用量优化 | 第30页 |
| 2.2.17.2 甘氨酸的用量优化 | 第30-31页 |
| 2.2.17.3 重组蛋白的用量优化 | 第31页 |
| 2.2.17.4 色价的测定 | 第31-32页 |
| 第三章 结果 | 第32-41页 |
| 3.1 质粒的构建与酶切验证 | 第32-36页 |
| 3.2 重组蛋白在不同宿主中的表达 | 第36-37页 |
| 3.3 重组蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| 3.4 诱导条件对重组蛋白表达的影响 | 第38页 |
| 3.4.1 诱导时机 | 第38页 |
| 3.4.2 中试放大生产 | 第38页 |
| 3.5 色素的转化 | 第38-41页 |
| 3.5.1 底物栀子苷的量 | 第38-39页 |
| 3.5.2 甘氨酸的量 | 第39-40页 |
| 3.5.3 重组蛋白的量 | 第40页 |
| 3.5.4 色价的测定 | 第40-41页 |
| 第四章 讨论 | 第41-45页 |
| 4.1 耐热性β-葡萄糖苷酶 | 第41-42页 |
| 4.2 重组蛋白的表达 | 第42-43页 |
| 4.3 重组蛋白的纯化 | 第43页 |
| 4.4 色素的转化 | 第43-45页 |
| 主要结论 | 第45-46页 |
| 全文主要创新点 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-52页 |
| 致谢 | 第52页 |
