| 摘要 | 第2-3页 |
| Abstract | 第3页 |
| 引言 | 第7-9页 |
| 第一章 Brevianamide A生物合成相关基因的挖掘、鉴定和克隆 | 第9-28页 |
| 1.1 材料和方法 | 第9-16页 |
| 1.1.1 材料 | 第9-10页 |
| 1.1.1.1 菌株和质粒 | 第9页 |
| 1.1.1.2 主要试剂 | 第9页 |
| 1.1.1.3 主要培养基及溶液 | 第9-10页 |
| 1.1.1.4 实验仪器 | 第10页 |
| 1.1.2 方法 | 第10-16页 |
| 1.1.2.1 Brevianamide A生物合成基因簇的获取 | 第10-11页 |
| 1.1.2.1.1 短密青霉菌的培养 | 第10页 |
| 1.1.2.1.2 短密青霉NRRL 864基因组提取 | 第10-11页 |
| 1.1.2.1.3 Brevianamide A编码基因的挖掘 | 第11页 |
| 1.1.2.2 Brevianamide A生物合成相关基因的克隆 | 第11-16页 |
| 1.1.2.2.1 短密青霉NRRL 864 RNA提取 | 第11-12页 |
| 1.1.2.2.2 短密青霉NRRL 864 RNA反转录 | 第12-13页 |
| 1.1.2.2.3 目的基因的扩增 | 第13页 |
| 1.1.2.2.4 扩增产物的回收 | 第13-14页 |
| 1.1.2.2.5 回收产物与载体连接 | 第14页 |
| 1.1.2.2.6 感受态的制备与重组载体的转化 | 第14-15页 |
| 1.1.2.2.7 阳性克隆的筛选与重组质粒提取鉴定 | 第15-16页 |
| 1.2 结果与分析 | 第16-27页 |
| 1.2.1 Brevianamide A编码基因的挖掘 | 第16-18页 |
| 1.2.2 短密青霉NRRL 864 RNA的提取 | 第18-19页 |
| 1.2.3 BvnB重组表达质粒构建 | 第19-20页 |
| 1.2.4 BvnB序列分析 | 第20-22页 |
| 1.2.5 BvnC重组表达质粒构建 | 第22页 |
| 1.2.6 BvnC序列分析 | 第22-24页 |
| 1.2.7 BvnD重组表达质粒构建 | 第24-25页 |
| 1.2.8 BvnD序列分析 | 第25-27页 |
| 本章小结 | 第27-28页 |
| 第二章 Brevianamide A生物合成相关基因的表达纯化 | 第28-33页 |
| 2.1 材料和方法 | 第28-32页 |
| 2.1.1 材料 | 第28-29页 |
| 2.1.1.1 菌株和质粒 | 第28页 |
| 2.1.1.2 主要试剂 | 第28页 |
| 2.1.1.3 主要培养基及溶液 | 第28-29页 |
| 2.1.1.4 实验仪器 | 第29页 |
| 2.1.2 方法 | 第29-30页 |
| 2.1.2.3 目的蛋白的诱导表达 | 第29-30页 |
| 2.1.2.2 目的蛋白的纯化 | 第30页 |
| 2.1.3 结果与分析 | 第30-32页 |
| 2.1.3.1 BvnB目的蛋白的表达与纯化 | 第30-31页 |
| 2.1.3.2 BvnC目的蛋白的表达与纯化 | 第31-32页 |
| 2.1.3.3 BvnD目的蛋白的表达与纯化 | 第32页 |
| 本章小结 | 第32-33页 |
| 第三章 BvnD可溶性表达探索及包涵体变性复性 | 第33-43页 |
| 3.1 材料和方法 | 第33-37页 |
| 3.1.1 材料 | 第33-35页 |
| 3.1.1.1 菌株和质粒 | 第33页 |
| 3.1.1.2 主要试剂 | 第33页 |
| 3.1.1.3 主要培养基及溶液 | 第33-34页 |
| 3.1.1.4 实验仪器 | 第34-35页 |
| 3.1.2 方法 | 第35-37页 |
| 3.1.2.1 BvnD可溶性表达探索 | 第35-37页 |
| 3.1.2.1.1 pSJ7-BvnD重组质粒和pMAL-c2x-BvnD重组质粒的构建 | 第35-36页 |
| 3.1.2.1.1.1 BvnD基因的扩增 | 第35页 |
| 3.1.2.1.1.2 扩增产物的回收 | 第35页 |
| 3.1.2.1.1.3 回收产物与载体连接 | 第35-36页 |
| 3.1.2.1.1.4 感受态的制备与重组载体的转化 | 第36页 |
| 3.1.2.1.1.5 筛选阳性克隆并提取质粒鉴定 | 第36页 |
| 3.1.2.1.2 重组蛋白在E.coli BL21（DE3）中的低温诱导表达 | 第36页 |
| 3.1.2.1.3 重组蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| 3.1.2.2 BvnD蛋白的冻融变性复性 | 第37页 |
| 3.2 结果与分析 | 第37-42页 |
| 3.2.1 pSJ7-BvnD重组表达质粒构建 | 第37-38页 |
| 3.2.2 重组NusA-BvnD蛋白的表达与纯化 | 第38-39页 |
| 3.2.3 pMAL-c2x-BvnD重组表达质粒构建 | 第39-40页 |
| 3.2.4 重组MBP-Bvn D蛋白的表达与纯化 | 第40-41页 |
| 3.2.5 BvnD蛋白的变性复性 | 第41-42页 |
| 本章小结 | 第42-43页 |
| 第四章 BvnC的功能分析及功能专一性研究 | 第43-48页 |
| 4.1 材料和方法 | 第43-44页 |
| 4.1.1 材料 | 第43页 |
| 4.1.1.1 主要试剂 | 第43页 |
| 4.1.1.2 实验仪器 | 第43页 |
| 4.1.2 方法 | 第43-44页 |
| 4.1.2.1 BvnC的最适底物检测 | 第43-44页 |
| 4.1.2.2 BvnC最适反应条件分析 | 第44页 |
| 4.1.2.3 BvnC的酶促反应动力学分析 | 第44页 |
| 4.1.2.4 金属离子对重组BvnC活性的影响 | 第44页 |
| 4.2 结果与分析 | 第44-47页 |
| 4.2.1 BvnC的底物选择性研究 | 第44-46页 |
| 4.2.2 BvnC最适反应温度和pH | 第46-47页 |
| 4.2.3 BvnC金属离子依赖性分析 | 第47页 |
| 4.2.4 BvnC米氏常数测定 | 第47页 |
| 本章小结 | 第47-48页 |
| 结论和展望 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-51页 |
| 综述 | 第51-62页 |
| 综述参考文献 | 第59-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 攻读学位期间研究成果 | 第63-64页 |
