| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-6页 |
| 缩略语索引 | 第6-11页 |
| 第一章 双歧杆菌丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展 | 第11-17页 |
| 前言 | 第11页 |
| ·Serpin的研究进展 | 第11-14页 |
| ·Serpin的结构 | 第11-12页 |
| ·Serpin的作用机制 | 第12-13页 |
| ·Serpin的功能 | 第13-14页 |
| ·双歧杆菌与Plg相互作用的研究 | 第14-16页 |
| ·Plg的结构 | 第14-15页 |
| ·双歧杆菌表面蛋白与Plg的黏附 | 第15-16页 |
| ·双歧杆菌中Serpin的研究意义 | 第16-17页 |
| 第二章 利用Plg筛选双歧杆菌表面蛋白 | 第17-42页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| ·材料和试剂 | 第18-19页 |
| ·菌株和质粒 | 第18页 |
| ·实验仪器设备及试剂 | 第18页 |
| ·培养基配制 | 第18页 |
| ·试剂配制 | 第18-19页 |
| ·实验方法 | 第19-30页 |
| ·提取pDNR-plg质粒 | 第19页 |
| ·PCR扩增μPlg基因 | 第19-20页 |
| ·回收PCR产物 | 第20-21页 |
| ·连接 | 第21页 |
| ·转化 | 第21-23页 |
| ·质粒提取 | 第23页 |
| ·测序 | 第23页 |
| ·DNA序列分析 | 第23页 |
| ·酶切及酶切产物的纯化 | 第23-24页 |
| ·连接 | 第24页 |
| ·转化 | 第24-25页 |
| ·pET22b(+)-μplg阳性克隆子菌落PCR验证 | 第25页 |
| ·重组质粒pET22b(+)-μplg提取 | 第25页 |
| ·双酶切表达载体鉴定阳性克隆子 | 第25-26页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及条件优化 | 第26页 |
| ·SDS-PAGE凝胶的制备 | 第26-27页 |
| ·SDS-PAGE检测表达蛋白 | 第27-28页 |
| ·包涵体的收集与溶解 | 第28页 |
| ·透析复性 | 第28-29页 |
| ·gPlg蛋白的纯化 | 第29页 |
| ·gPlg蛋白与磁珠偶联,捕获双歧杆菌黏附蛋白 | 第29-30页 |
| ·结果 | 第30-40页 |
| ·提取pDNR-μplg质粒 | 第30页 |
| ·PCR扩增μplg | 第30-31页 |
| ·PCR产物的回收 | 第31页 |
| ·菌落PCR验证阳性克隆 | 第31-32页 |
| ·提取重组质粒 | 第32页 |
| ·酶切验证阳性克隆 | 第32-33页 |
| ·测序结果 | 第33页 |
| ·提取pMD18-T-μplg和pET22b(+)质粒 | 第33-34页 |
| ·μplg和pET22b(+)双酶切回收结果 | 第34页 |
| ·菌落PCR验证阳性克隆 | 第34-35页 |
| ·重组质粒提取结果 | 第35页 |
| ·酶切验证阳性克隆 | 第35-36页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达结果 | 第36-37页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测复性结果 | 第37-39页 |
| ·SDS-PAGE验证纯化结果 | 第39页 |
| ·SDS-PAGE验证蛋白黏附结果 | 第39-40页 |
| ·讨论 | 第40-42页 |
| 第三章 Serpin的多抗制备和产Serpin菌株的筛选 | 第42-59页 |
| 前言 | 第42页 |
| ·实验材料、设备及试剂 | 第42-44页 |
| ·菌株及质粒 | 第42-44页 |
| ·实验仪器设备及试剂 | 第44页 |
| ·试剂配制 | 第44页 |
| ·培养基配制 | 第44页 |
| ·实验方法 | 第44-50页 |
| ·引物设计与serpin基因的扩增 | 第44-45页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第45页 |
| ·双酶切及酶切产物纯化 | 第45-46页 |
| ·连接 | 第46页 |
| ·转化 | 第46-47页 |
| ·pBX_2-serpin阳性克隆子菌落PCR验证 | 第47页 |
| ·重组表达载体pBX2-serpin的提取 | 第47页 |
| ·双酶切表达载体鉴定阳性克隆子 | 第47页 |
| ·目标蛋白的诱导表达 | 第47-48页 |
| ·Serpin蛋白的纯化 | 第48页 |
| ·免疫小鼠制备抗血清 | 第48页 |
| ·间接ELISA法检测抗体效价 | 第48-49页 |
| ·多克隆抗体的特异性纯化 | 第49页 |
| ·抗体洗脱效率分析 | 第49页 |
| ·多克隆抗体的特异性检测 | 第49-50页 |
| ·斑点杂交法筛选双歧杆菌中的类Serpin蛋白 | 第50页 |
| ·结果 | 第50-57页 |
| ·Serpin的扩增结果 | 第50页 |
| ·pBX_2质粒的提取 | 第50-51页 |
| ·目的片段serpin和表达载体双酶切产物回收检测 | 第51页 |
| ·菌落PCR验证阳性克隆子 | 第51-52页 |
| ·双酶切验证阳性克隆子 | 第52页 |
| ·抗原表达 | 第52-53页 |
| ·Serpin蛋白纯化 | 第53-54页 |
| ·多抗效价检测 | 第54页 |
| ·抗体纯化结果 | 第54-55页 |
| ·不同溶液对抗体洗脱效率的影响 | 第55页 |
| ·交叉反应 | 第55-57页 |
| ·斑点杂交 | 第57页 |
| ·讨论 | 第57-59页 |
| 第四章 插入失活载体的构建 | 第59-68页 |
| 前言 | 第59页 |
| ·材料和试剂 | 第59-60页 |
| ·菌株和质粒 | 第59页 |
| ·实验仪器设备及试剂 | 第59页 |
| ·试剂配制 | 第59-60页 |
| ·培养基配制 | 第60页 |
| ·实验方法 | 第60-63页 |
| ·提取pMD18-T-serpin和pNZ44质粒 | 第60页 |
| ·引物设计与扩增氯霉素抗性基因cmr | 第60-61页 |
| ·回收PCR产物 | 第61页 |
| ·单酶切及酶切产物纯化 | 第61页 |
| ·开环质粒进行去磷酸化反应与回收 | 第61-62页 |
| ·连接 | 第62页 |
| ·将连接产物转化入感受态细胞DH5α | 第62-63页 |
| ·pMD18-T/serpin-cmr阳性克隆子菌落PCR验证 | 第63页 |
| ·单酶切表达载体鉴定阳性克隆 | 第63页 |
| ·测序 | 第63页 |
| ·结果与分析 | 第63-66页 |
| ·pMD18-T-serpin和pNZ44质粒提取结果 | 第63-64页 |
| ·cmr的扩增结果 | 第64页 |
| ·目的片段cmr和载体pMD18-T-serpin酶切产物回收检测 | 第64-65页 |
| ·载体pMD18-T-serpin去磷酸化后回收检测 | 第65页 |
| ·菌落PCR验证阳性克隆子 | 第65-66页 |
| ·酶切验证阳性克隆 | 第66页 |
| ·讨论 | 第66-68页 |
| 第五章 结论与展望 | 第68-70页 |
| ·结论 | 第68-69页 |
| ·Plg对双歧杆菌表面蛋白的黏附研究 | 第68页 |
| ·Serpin多克隆抗体的制备与筛选产Serpin菌株 | 第68页 |
| ·Serpin插入失活载体的构建 | 第68-69页 |
| ·展望 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-74页 |
| 附录 | 第74-80页 |
| 附录A1 仪器设备 | 第74-75页 |
| 附录A2 试剂 | 第75-76页 |
| 附录B | 第76-78页 |
| 附录C DNA测序结果 | 第78-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 个人介绍 | 第81页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第81页 |
