| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第11-19页 |
| 1.1 环己胺简介及研究意义 | 第11-12页 |
| 1.2 环己酮介绍 | 第12页 |
| 1.3 环己胺降解菌的研究 | 第12-13页 |
| 1.4 环己胺微生物降解代谢过程 | 第13-15页 |
| 1.5 基因功能研究 | 第15页 |
| 1.6 基因敲除方法 | 第15-18页 |
| 1.7 实验流程图 | 第18-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-21页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第19页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第19页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第19页 |
| 2.1.4 主要溶液和培养基 | 第19-21页 |
| 2.2 实验方法 | 第21-35页 |
| 2.2.1 PCR产物胶回收 | 第21页 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态制备 | 第21-22页 |
| 2.2.3 重组质粒转化至感受态细胞 | 第22页 |
| 2.2.4 质粒DNA提取 | 第22页 |
| 2.2.5 试剂盒提取细菌基因组 | 第22-23页 |
| 2.2.6 煮沸法提取基因组 | 第23页 |
| 2.2.7 基因敲除引物设计 | 第23-25页 |
| 2.2.8 无痕敲除(以amo4637无痕敲除为例) | 第25-30页 |
| 2.2.9 chnB基因回补实验 | 第30-32页 |
| 2.2.10 气相色谱 | 第32页 |
| 2.2.11 生长曲线测定 | 第32-33页 |
| 2.2.12 荧光定量 | 第33-34页 |
| 2.2.13 转录组 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-76页 |
| 3.1 amo2631插入突变 | 第35-39页 |
| 3.1.1 同源臂扩增及融合PCR | 第35-36页 |
| 3.1.2 敲除载体的构建 | 第36页 |
| 3.1.3 单交换鉴定 | 第36-37页 |
| 3.1.4 双交换鉴定 | 第37-39页 |
| 3.2 amo2631无痕敲除 | 第39-44页 |
| 3.2.1 同源臂扩增及融合PCR | 第39-40页 |
| 3.2.2 目的基因与敲除载体连接与鉴定 | 第40-41页 |
| 3.2.3 单交换鉴定 | 第41-42页 |
| 3.2.4 双交换鉴定 | 第42-43页 |
| 3.2.5 测序结果 | 第43页 |
| 3.2.6 突变菌株生长实验 | 第43-44页 |
| 3.3 amo4207无痕敲除 | 第44-49页 |
| 3.3.1 同源臂扩增及融合PCR | 第44-45页 |
| 3.3.2 目的基因与敲除载体连接与鉴定 | 第45-46页 |
| 3.3.3 单交换鉴定 | 第46-47页 |
| 3.3.4 双交换鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3.5 测序结果 | 第48-49页 |
| 3.3.6 生长实验 | 第49页 |
| 3.4 amo425无痕敲除 | 第49-54页 |
| 3.4.1 同源臂扩增及融合PCR | 第49-50页 |
| 3.4.2 目的基因与敲除载体连接与鉴定 | 第50-51页 |
| 3.4.3 单交换鉴定 | 第51-52页 |
| 3.4.4 双交换鉴定 | 第52-53页 |
| 3.4.5 测序结果 | 第53-54页 |
| 3.4.6 生长实验 | 第54页 |
| 3.5 amo4637无痕敲除 | 第54-59页 |
| 3.5.1 同源臂扩增及融合PCR | 第54-55页 |
| 3.5.2 目的基因与敲除载体连接与鉴定 | 第55-56页 |
| 3.5.3 单交换鉴定 | 第56-57页 |
| 3.5.4 双交换鉴定 | 第57页 |
| 3.5.5 敲除菌株测序结果 | 第57-58页 |
| 3.5.6 生长实验 | 第58-59页 |
| 3.6 amo5539无痕敲除 | 第59-63页 |
| 3.6.1 同源臂扩增及融合PCR | 第59页 |
| 3.6.2 目的基因与敲除载体连接与鉴定 | 第59-60页 |
| 3.6.3 单交换鉴定 | 第60-61页 |
| 3.6.4 双交换鉴定 | 第61-62页 |
| 3.6.5 测序结果 | 第62页 |
| 3.6.6 生长实验 | 第62-63页 |
| 3.7 转录组及荧光定量结果 | 第63-67页 |
| 3.8 chnB无痕敲除 | 第67-72页 |
| 3.8.1 同源臂扩增及融合PCR | 第67-68页 |
| 3.8.2 目的基因与敲除载体连接与鉴定 | 第68页 |
| 3.8.3 单交换鉴定 | 第68-69页 |
| 3.8.4 双交换鉴定 | 第69-70页 |
| 3.8.5 测序结果 | 第70-71页 |
| 3.8.6 生长实验 | 第71页 |
| 3.8.7 中间产物环己酮气相色谱 | 第71-72页 |
| 3.9 chnB回补实验 | 第72-76页 |
| 3.9.1 chnB基因扩增 | 第72-73页 |
| 3.9.2 目的基因与回补载体连接与鉴定 | 第73-74页 |
| 3.9.3 基因回补鉴定 | 第74-75页 |
| 3.9.4 生长实验 | 第75-76页 |
| 4 结论与讨论 | 第76-78页 |
| 4.1 结论 | 第76-77页 |
| 4.2 实验创新之处 | 第77页 |
| 4.3 工作展望 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 附录 | 第84-87页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第87页 |