基于酶级联扩增及DNA支架核酸传感分析方法的研究

【摘要】：随着分析学科的不断发展与完善,各种分析检测手段越来越需要借助生物传感技术获取必需的信息。生物传感技术方法因为其具备灵敏性好、选择性好、分析迅速及成本低等优势而迅速发展。但随着目标物质检测水平的不断提高及科研的不断深入,对生物传感检测手段的要求越来越高。因此,开发高灵敏、高特异性和精确的传感方法用于物质的定量或定向检测受到了科学研究者的广泛关注。针对以上考虑,本文借助核酸适体,结合工具酶级联扩增信号放大方法和DNA为支架构建荧光探针等技术,以L-组氨酸及金属离子为研究对象,具体完成以下工作：构建了一种新型的基于酶级联扩增反应用于信号放大法检测L-组氨酸。这是第一次尝试联用DNA核酶及聚合酶/内切酶循环反应导致直接活化的酶级联反应。当L-组氨酸存在时,能够在脱氧核酶的特异性切割位点(核糖核苷酸rA)处切割底物链,释放出含rA的短链可与模板链复合杂交形成不完全互补双链DNA,在Klenow DNA聚合酶和Nb.BbVCI切刻酶的作用下,级联扩增反应发生并形成更多的双链DNA,然后引入荧光双链嵌入剂SYBR Greenl (SG)嵌入到双链DNA中得到荧光信号。由于工具酶的高特异性和强的催化效应,该传感分析方法有效提高了L-组氨酸检测的灵敏性及选择性。在最优实验条件下,L-组氨酸浓度的对数值与荧光强度在50 nM-1.0 mM范围内呈现指数级关系,计算得出检测下限为6.34 nM,表明该种基于核酶级联扩增方法在将来的临床试验中同样显示出巨大的潜力。研究了一种以DNA为模板合成的银纳米簇(AgNCs)作为荧光信号探针,用于汞离子(Hg2+)的简便、快速且灵敏检测。银离子(Ag+)可与胞嘧啶(Cytosine, C)碱基高特异性的结合,形成稳定的C-Ag+-C错配结构之后,使用硼氢化钠还原后形成DNA-AgNCs,显现出强荧光信号。当在DNA-AgNCs溶液中加入Hg2+之后,由于金属之间的相互作用,导致DNA-AgNCs荧光明显淬灭。在最佳实验条件下,Hg2+溶液浓度在5.0 nM-8.0 μM范围内,Hg2+溶液浓度的对数值与DNA-AgNCs溶液的荧光强度值呈线性关系；依据三倍标准偏差法,计算得出该检测体系的检测限为1.57 nM。该传感分析方法可将I)NA-AgNCs的应用扩展到环境监测领域。利用C-Ag+-C的特殊结构且氧化石墨烯存在荧光淬灭的特性,构建了一种简单灵敏的荧光传感分析方法用于银离子的检测。富含胞嘧啶(Cytosine, C)的发卡探针在银离子(Ag+)存在的情况下,自行折叠或两两错配形成稳定的C-Ag+-C结构,将SYBR Greenl(SG)嵌入到双链DNA中,SG荧光强度增大,氧化石墨烯的引入,导致能量共振诱导电子转移,使部分游离的SG荧光熄灭。而发卡探针在无Ag+存在的情况下,仅茎部结构能够自组装少量的SG,而环状结构呈单链状态与GO发生吸附。由于能量传递以及电子转移作用下,SG能够π-π吸附到GO上,从而使得SG的荧光在一定程度上淬灭。因此,氧化石墨烯的加入能有效提高传感体系的信背比。实验结果表明,SG荧光强度与20nM～2.0μM的银离子呈良好的线性关系,检出限为6.47 nM。本方法选择性好,5倍于银离子浓度的其它常见金属离子干扰较小,检测湖水水样中银离子的回收率为93.37%-101.2%,可用于实际样品的检测。
【关键词】：级联扩增 DNA支架 荧光光谱法 L-组氨酸 重金属离子 生物传感分析
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：O657.3