| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 1. 前言 | 第12-22页 |
| ·壳聚糖与壳寡糖 | 第12-14页 |
| ·壳聚糖酶 | 第14-17页 |
| ·壳聚糖酶的来源与分类 | 第14页 |
| ·壳聚糖酶的生化特性 | 第14-15页 |
| ·壳聚糖酶的结构与作用机理 | 第15-16页 |
| ·壳聚糖酶的开发前景 | 第16-17页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第17-21页 |
| ·宿主菌株 | 第17-18页 |
| ·表达载体 | 第18页 |
| ·表达策略 | 第18-20页 |
| ·发酵条件优化 | 第20-21页 |
| ·本研究的目的及意义 | 第21-22页 |
| 2. 材料与方法 | 第22-39页 |
| ·材料 | 第22-27页 |
| ·菌株与质粒 | 第22页 |
| ·试剂 | 第22-23页 |
| ·生物学软件和网站 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23-24页 |
| ·溶液 | 第24-26页 |
| ·仪器设备 | 第26-27页 |
| ·壳聚糖酶基因的克隆与测序 | 第27-28页 |
| ·PCR扩增壳聚糖酶基因 | 第27页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第27-28页 |
| ·TA克隆、转化与测序 | 第28页 |
| ·壳聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第28-33页 |
| ·密码子的优化 | 第28-29页 |
| ·基因序列的PCR扩增与酶切 | 第29-30页 |
| ·pPIC9K载体酶切、脱磷 | 第30页 |
| ·酶连与大肠杆菌转化 | 第30-31页 |
| ·毕赤酵母感受态的制备 | 第31-32页 |
| ·重组质粒的转化 | 第32-33页 |
| ·壳聚糖酶的诱导表达与酶活检测 | 第33页 |
| ·高拷贝重组酵母的筛选 | 第33页 |
| ·表达产物的纯化与检测 | 第33-36页 |
| ·壳聚糖酶的纯化 | 第33-34页 |
| ·TCA沉淀 | 第34页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第34-35页 |
| ·糖基化分析与Western blot检测 | 第35-36页 |
| ·酶学性质研究 | 第36-37页 |
| ·氨基葡萄糖标准曲线 | 第36页 |
| ·壳聚糖酶酶活的测定 | 第36-37页 |
| ·壳聚糖酶最适pH | 第37页 |
| ·壳聚糖酶最适反应温度 | 第37页 |
| ·壳聚糖酶的底物特异性 | 第37页 |
| ·金属离子与EDTA对壳聚糖酶活性的影响 | 第37页 |
| ·高密度细胞发酵 | 第37-39页 |
| ·种子液的培养 | 第38页 |
| ·菌体生长阶段 | 第38页 |
| ·甲醇诱导表达阶段 | 第38-39页 |
| 3. 结果与分析 | 第39-52页 |
| ·壳聚糖酶基因的克隆与测序 | 第39页 |
| ·基因组抽取 | 第39页 |
| ·PCR扩增与测序 | 第39页 |
| ·密码子优化 | 第39-43页 |
| ·毕赤酵母、ori-choA1及opt-choA1基因的密码子使用情况比较 | 第40-41页 |
| ·ori-choA1和opt-choA1的CAI值比较 | 第41页 |
| ·ori-choA1和opt-choA1的GC含量分布 | 第41页 |
| ·ori-choA1和opt-choA1的mRNA二级结构 | 第41-43页 |
| ·毕赤酵母表达 | 第43-48页 |
| ·重组质粒的构建及验证 | 第43-46页 |
| ·重组酵母的验证 | 第46-47页 |
| ·不同表型重组菌株的酶活比较 | 第47页 |
| ·高拷贝数重组菌株的筛选 | 第47-48页 |
| ·表达产物的检测与分析 | 第48-49页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第48页 |
| ·糖基化分析 | 第48-49页 |
| ·Western blot检测糖基化 | 第49页 |
| ·酶学性质分析 | 第49-51页 |
| ·最适温度 | 第49-50页 |
| ·最适pH | 第50页 |
| ·底物特异性 | 第50-51页 |
| ·高密度细胞发酵 | 第51-52页 |
| 4. 小结与讨论 | 第52-56页 |
| ·基因序列的优化 | 第52页 |
| ·基因拷贝数的提高 | 第52-53页 |
| ·壳聚糖酶酶活 | 第53页 |
| ·发酵条件的优化 | 第53-56页 |
| ·pH的优化 | 第54页 |
| ·甲醇利用表型的选择 | 第54页 |
| ·甲醇添加量的优化 | 第54-55页 |
| ·菌体浓度 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
