| 中文摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-51页 |
| 1 纤维素酶的研究进展 | 第16-34页 |
| ·纤维素的研究概况 | 第16-18页 |
| ·纤维素酶研究进展 | 第18-32页 |
| ·纤维素酶的应用 | 第32-34页 |
| 2 酶的分子改造 | 第34-44页 |
| ·酶定向进化产生的背景 | 第35页 |
| ·构建突变文库的方法 | 第35-37页 |
| ·文库筛选的方法 | 第37-40页 |
| ·基因融合技术 | 第40页 |
| ·分子改造的应用 | 第40-44页 |
| 3 纤维素酶的分子改造 | 第44-51页 |
| ·不同家族纤维素酶的定点突变 | 第45页 |
| ·纤维素酶的定向进化 | 第45-51页 |
| 第二章 嗜热真菌内切葡聚糖酶eg1 基因的克隆及在毕赤酵母中的表达 | 第51-88页 |
| 1. 材料和方法 | 第51-72页 |
| ·材料 | 第51-55页 |
| ·供试菌株 | 第51-52页 |
| ·菌株与质粒 | 第52页 |
| ·酶和生化试剂 | 第52页 |
| ·仪器 | 第52页 |
| ·溶液及培养基配制 | 第52-55页 |
| ·试验方法 | 第55-63页 |
| ·PCR 引物设计 | 第55页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第55-56页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第56页 |
| ·eg1 基因的PCR 扩增 | 第56-57页 |
| ·PCR 产物回收 | 第57-59页 |
| ·与载体连接 | 第59页 |
| ·E.coli 感受态细胞的制备和转化 | 第59-60页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第60-63页 |
| ·序列测定 | 第63页 |
| ·序列的生物信息学分析 | 第63页 |
| ·内切葡聚糖酶eg1 在毕赤酵母中的高效表达 | 第63-72页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第63-64页 |
| ·线性化酶切 | 第64-65页 |
| ·酵母转化 | 第65-66页 |
| ·酵母转化子的筛选 | 第66-67页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第67-69页 |
| ·酵母工程菌的培养和内切葡聚糖酶eg1 的诱导分泌表达 | 第69-70页 |
| ·表达产物的生物学活性检测及表达产物的SDS-PAGE | 第70-71页 |
| ·内切葡聚糖酶eg1 工程菌表达产物的纯化及酶学性质 | 第71-72页 |
| 2 实验结果 | 第72-86页 |
| ·T.aurantiacus var.levisporus 总RNA 的提取 | 第72页 |
| ·eg1 基因成熟蛋白编码序列的克隆 | 第72-73页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶eg1 基因序列测定与分析 | 第73-75页 |
| ·内切葡聚糖酶Ⅰ基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第75-76页 |
| ·内切葡聚糖酶Ⅰ基因eg1 的核苷酸序列分析 | 第75页 |
| ·内切葡聚糖酶Ⅰ基因eg1 的氨基酸序列分析 | 第75-76页 |
| ·内切葡聚糖eg1 在毕赤酵母中的表达 | 第76-78页 |
| ·毕赤酵母的电击转化和重组菌株的鉴定 | 第78-81页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第78-79页 |
| ·eg1 基因多拷贝整合子的筛选 | 第79-80页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第80-81页 |
| ·内切葡聚糖酶eg1 基因在酵母中的高效表达及表达产物的检测 | 第81-86页 |
| ·定内切葡聚糖酶eg1基因在P.pastoris中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选 | 第81页 |
| ·内切葡聚糖酶eg1 基因酵母工程菌产酶SDS-PAGE | 第81页 |
| ·内切葡聚糖酶eg1 基因表达产物的分析 | 第81-82页 |
| ·内切葡聚糖酶工程菌的遗传稳定性分析 | 第82-83页 |
| ·表达内切葡聚糖酶的纯化及酶学性质研究 | 第83-86页 |
| 3 讨论 | 第86-88页 |
| 第三章 嗜热真菌纤维素酶的分子改造 | 第88-148页 |
| 第一节 嗜热真菌内切葡聚糖酶 eg1 的定向进化 | 第88-108页 |
| 1 材料和方法 | 第88-96页 |
| ·材料 | 第88-89页 |
| ·供试菌株 | 第89页 |
| ·菌株与质粒 | 第89页 |
| ·酶和生化试剂 | 第89页 |
| ·试验方法 | 第89-91页 |
| ·PCR 引物设计 | 第89页 |
| ·易错PCR | 第89-90页 |
| ·易错PCR 产物回收 | 第90页 |
| ·易错PCR 产物双酶切 | 第90页 |
| ·酶切产物纯化 | 第90-91页 |
| ·表达载体pPIC9K 的酶切和纯化 | 第91页 |
| ·表达载体pPIC9K 的酶切 | 第91页 |
| ·pPIC9K 的酶切纯化 | 第91页 |
| ·突变体库的构建 | 第91-94页 |
| ·易错PCR 产物与载体的连接 | 第91-92页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌JM109 | 第92页 |
| ·重组质粒的提取 | 第92页 |
| ·线性化质粒DNA 制备 | 第92-94页 |
| ·酵母转化 | 第94页 |
| ·突变体库的筛选方法 | 第94-95页 |
| ·正向突变子的初步筛选 | 第94页 |
| ·正向突变子的复筛 | 第94页 |
| ·摇瓶发酵确定突变体 | 第94-95页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第95页 |
| ·突变内切葡聚糖酶neg1 工程菌表达产物的纯化及酶学性质 | 第95-96页 |
| ·突变内切葡聚糖酶neg1 工程菌表达产物的纯化 | 第95-96页 |
| ·突变内切葡聚糖酶neg1 工程菌表达产物的酶学性质 | 第96页 |
| ·突变基因序列测定 | 第96页 |
| 2 实验结果 | 第96-105页 |
| ·易错PCR 突变库的建立和筛选结果 | 第96页 |
| ·正向突变基因的筛选 | 第96-98页 |
| ·双层平板初筛 | 第97页 |
| ·小量液体发酵法复筛 | 第97页 |
| ·酶活力测定 | 第97页 |
| ·NT0542 酵母工程菌产酶SDS-PAGE | 第97-98页 |
| ·突变体NT0542 蛋白的纯化 | 第98-100页 |
| ·DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 | 第98页 |
| ·Phenyl-Sepharose 疏水柱层析 | 第98-100页 |
| ·突变体NT0542 的一般性质 | 第100-103页 |
| ·突变体的最适温度 | 第100-101页 |
| ·突变体的最适pH | 第101页 |
| ·表达突变内切葡聚糖酶的热稳定性 | 第101-102页 |
| ·突变酶的底物特异性 | 第102-103页 |
| ·突变体NT0542的序列测定 | 第103-105页 |
| 3 讨论 | 第105-108页 |
| ·突变库的构建 | 第105页 |
| ·筛选方法 | 第105-106页 |
| ·突变内切葡聚糖酶的酶活提高的因素 | 第106-107页 |
| ·纤维素酶的定向进化 | 第107-108页 |
| 第二节 嗜热子囊菌光孢变种eg1 基因和嗜热毛壳菌cbh1 基因的融合 | 第108-124页 |
| 1. 材料和方法 | 第108-113页 |
| ·材料 | 第108-109页 |
| ·供试菌株 | 第108页 |
| ·菌株与质粒 | 第108页 |
| ·酶和生化试剂 | 第108-109页 |
| ·仪器 | 第109页 |
| ·溶液及培养基配制 | 第109页 |
| ·试验方法 | 第109-111页 |
| ·PCR 引物设计 | 第109-110页 |
| ·eg1cbh1 和cbh1eg1 融合基因的PCR 扩增 | 第110-111页 |
| ·融合eg1cbh1 和cbh1eg1 全长PCR 产物回收 | 第111页 |
| ·融合基因eg1cbh1 和cbh1eg1 在毕赤酵母中的高效表达 | 第111-113页 |
| 2 结果与分析 | 第113-123页 |
| ·融合基因独立片段的获得 | 第113-114页 |
| ·融合基因cbh1eg1 的独立片段的PCR 扩增 | 第113页 |
| ·融合基因eg1cbh1 的独立片段的PCR 扩增 | 第113-114页 |
| ·融合基因cbh1eg1 和eg1cbh1 全长的PCR 扩增 | 第114-115页 |
| ·融合基因cbh1eg1 和eg1cbh1 在毕赤酵母中的表达 | 第115-120页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第115-118页 |
| ·重组酵母表达质粒 pPIC9K/ec11 和 pPIC9K/ce11 转化 P.pastoris GS115 及酵母转化 子的筛选 | 第118-120页 |
| ·融合酶 eg1cbh1 和 cbh1eg1 基因在 P.pastoris 中的表达产物的检测 | 第120-123页 |
| ·融合酶eg1cbh1 酵母工程菌产酶产酶曲线分析及SDS-PAGE | 第120-121页 |
| ·融合酶基因eg1cbh1 表达产物的分析 | 第121-122页 |
| ·融合酶 eg1cbh1 的底物特异性 | 第122-123页 |
| 3 讨论 | 第123-124页 |
| 第三节 嗜热毛壳菌cbh3 基因与纤维素结合区CBD 的基因融合 | 第124-148页 |
| 1. 材料和方法 | 第124-134页 |
| ·材料 | 第124-125页 |
| ·试验方法 | 第125-132页 |
| ·融合基因cbh3-1 在毕赤酵母中的高效表达 | 第132-134页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第132-133页 |
| ·线性化质粒DNA 制备 | 第133-134页 |
| 2 结果与分析 | 第134-146页 |
| ·融合基因独立片段的获得 | 第134页 |
| ·融合基因cbh3-1A 的独立片段的PCR 扩增 | 第134页 |
| ·融合基因cbh3-1B 的独立片段的PCR 扩增 | 第134页 |
| ·融合基因cbh3-1 全长的PCR 扩增 | 第134-137页 |
| ·融合基因cbh3-1A 和cbh3-1B 在毕赤酵母中的表达 | 第137-142页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第137-139页 |
| ·重组酵母表达质粒 pPIC9K/cbh31A 和 pPIC9K/cbh31B 转化 P.pastoris GS115 及酵 母转化子的筛选 | 第139-142页 |
| ·融合酶 cbh31 基因在 Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第142-143页 |
| ·融合酶 cbh31 基因在 Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选 | 第142页 |
| ·融合酶cbh31B 酵母工程菌产酶SDS-PAGE | 第142页 |
| ·融合酶酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第142-143页 |
| ·表达融合酶的纯化及酶学性质研究 | 第143-146页 |
| ·表达融合酶的纯化 | 第143-144页 |
| ·表达融合酶 cbh31 的最适反应温度 | 第144页 |
| ·表达融合酶 cbh31 的最适反应 pH 值 | 第144-145页 |
| ·表达融合酶 cbh31 的热稳定性 | 第145-146页 |
| ·融合酶的底物特异性 | 第146页 |
| 3 讨论 | 第146-148页 |
| 第四章 全文结论与建议 | 第148-150页 |
| 1 结论 | 第148-149页 |
| 2 建议 | 第149-150页 |
| 参考文献 | 第150-170页 |
| 致谢 | 第170-171页 |
| 攻读学位期间发表论文的情况 | 第171页 |
