| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 缩略词表 | 第9-17页 |
| 文献综述 | 第17-40页 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 | 第17-40页 |
| 1.PRRSV流行病学概述 | 第17-18页 |
| 2.病原学 | 第18-25页 |
| ·病毒形态及理化特性 | 第18-19页 |
| ·病毒的侵入及CPE | 第19页 |
| ·分子生物学 | 第19-22页 |
| ·病毒的基因组结构 | 第19-20页 |
| ·病毒基因组所编码的蛋白 | 第20-22页 |
| ·PRRSV的不断变异 | 第22-25页 |
| 3.高致病性猪蓝耳病 | 第25-29页 |
| ·猪高热病的发生与流行概况 | 第25-26页 |
| ·高致病性猪蓝耳病的临床症状 | 第26-27页 |
| ·高致病性猪蓝耳病的大体病变 | 第27页 |
| ·高致病性猪蓝耳病的种属和特点 | 第27-28页 |
| ·高致病性猪蓝耳病的抵抗力和致病机理 | 第28页 |
| ·高致病性猪蓝耳病的临床诊断要点 | 第28页 |
| ·高致病性猪蓝耳病的危害 | 第28-29页 |
| 4.PRRSV的检测方法 | 第29-33页 |
| ·病毒分离培养方法 | 第29页 |
| ·抗原检测方法 | 第29-31页 |
| ·免疫过氧化物酶技术(immunoperoxidase tech-nique,IP) | 第29-30页 |
| ·荧光标记抗体法 | 第30页 |
| ·核酸探针杂交技术 | 第30页 |
| ·反转录-聚合酶链反应(RT-PCR) | 第30-31页 |
| ·血清学抗体检测方法 | 第31-33页 |
| ·免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA) | 第31页 |
| ·间接荧光抗体试验(IFA) | 第31-32页 |
| ·血清中和试验(Serum Neutralization Test SNT) | 第32页 |
| ·乳胶凝集试验(latex agglutination test,LAT) | 第32页 |
| ·酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) | 第32-33页 |
| ·免疫胶体金技术 | 第33页 |
| ·免疫金电镜技术 | 第33页 |
| ·彩色免疫金银染色法(Colour Immune-gold Silver Staining AssayCIGSS) | 第33页 |
| ·斑点金免疫渗滤测定法(Dot Immune-gold Filtration Assay DIGFA) | 第33页 |
| ·胶体金免疫层析法(Gold Immune Chromatography Assay,GICA) | 第33页 |
| 5 实时荧光定量PCR技术 | 第33-40页 |
| ·两个重要概念 | 第34页 |
| ·荧光阈值(Threshold) | 第34页 |
| ·循环阈值(Cycle Threshold value,Ct) | 第34页 |
| ·FQ-PCR反应方法的分类 | 第34-36页 |
| ·非特异性DNA结合染料法 | 第35页 |
| ·TaqMan探针法 | 第35页 |
| ·分子信标(molecular beacons) | 第35-36页 |
| ·双杂交探针(Light cycler) | 第36页 |
| ·复合探针法 | 第36页 |
| ·FQ-PCR在预防兽医学中的应用 | 第36-38页 |
| ·在细菌病诊断中的应用 | 第37页 |
| ·在动物病毒检测和鉴定上的应用 | 第37页 |
| ·在寄生虫诊断中的应用 | 第37-38页 |
| ·FQ-PCR在畜牧兽医业中的应用 | 第38-39页 |
| ·在动物检疫领域中的应用 | 第38页 |
| ·细胞因子表达定量检测 | 第38页 |
| ·环境监测中的应用 | 第38-39页 |
| ·转基因生物中的应用 | 第39页 |
| ·小结 | 第39-40页 |
| 实验研究 | 第40-86页 |
| 第二章 荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV方法的建立 | 第40-78页 |
| 前言 | 第40页 |
| 1.材料 | 第40-43页 |
| ·菌株/毒株/载体 | 第40-41页 |
| ·主要试剂及配制 | 第41-43页 |
| ·试剂盒 | 第41页 |
| ·试验用各种培养基的配制 | 第41-42页 |
| ·试验用各种溶液的配制 | 第42页 |
| ·电泳用主要试剂的配制 | 第42-43页 |
| ·主要仪器设备 | 第43页 |
| ·其他化学及生化试剂 | 第43页 |
| ·主要用的生物信息软件及网站 | 第43页 |
| 2.实验方法 | 第43-53页 |
| ·标准品的制备和鉴定 | 第43-46页 |
| ·重组质粒pMD-Nsp2的小量提取 | 第43-44页 |
| ·重组质粒pMD-Nsp2的鉴定 | 第44-45页 |
| ·SC-JX01株Nsp2基因生物信息学分析 | 第45-46页 |
| ·重组质粒pMD-Nsp2的浓度测定 | 第46页 |
| ·病毒核酸的提取 | 第46-48页 |
| ·高致病性PRRSV阳性血清RNA的提取 | 第46页 |
| ·其他RNA病毒核酸的提取及反转录 | 第46-47页 |
| ·DNA病毒核酸的提取 | 第47-48页 |
| ·PPE阳性组织病料DNA的提取 | 第48页 |
| ·荧光定量RT-PCR引物和探针的设计与合成 | 第48-49页 |
| ·荧光定量RT-PCR引物合理性的验证 | 第49-50页 |
| ·荧光定量RT-PCR引物合理性的电泳鉴定 | 第49页 |
| ·荧光定量RT-PCR引物合理性的熔解曲线分析 | 第49-50页 |
| ·荧光定量RT-PCR产物的测序验证 | 第50页 |
| ·荧光定量RT-PCR的优化 | 第50-51页 |
| ·Nsp2-Power SybrGreenRT-PCR引物浓度的优化 | 第50页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR引物浓度和探针浓度的优化 | 第50-51页 |
| ·循环参数的优化 | 第51页 |
| ·荧光定量RT-PCR与Con-PCR的敏感性比较 | 第51-52页 |
| ·荧光定量RT-PCR的敏感性 | 第51页 |
| ·检测试剂盒(Con-PCR)的敏感性 | 第51-52页 |
| ·荧光定量RT-PCR标准曲线的制作 | 第52页 |
| ·荧光定量RT-PCR的特异性检测 | 第52页 |
| ·荧光定量RT-PCR的重复性检测 | 第52-53页 |
| ·Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR的重复性 | 第52页 |
| ·Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR的稳定性 | 第52-53页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR的重复性 | 第53页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR的稳定性 | 第53页 |
| 3.结果 | 第53-73页 |
| ·重组质粒pMD-Nsp2的鉴定与序列分析及定量 | 第53-61页 |
| ·重组质粒pMD-Nsp2的鉴定 | 第53页 |
| ·SC-JX01株Nsp2基因生物信息学分析结果 | 第53-59页 |
| ·SC-JX01株Nsp2基因编码的蛋白质理化性质的分析 | 第59-61页 |
| ·重组质粒pMD-Nsp2的浓度测定 | 第61页 |
| ·提取高致病性PRRSV阳性血清的鉴定 | 第61-62页 |
| ·荧光定量RT-PCR引物合理性的验证 | 第62-63页 |
| ·引物合理性的电泳验证 | 第62页 |
| ·引物合理性的熔解曲线分析 | 第62-63页 |
| ·荧光定量RT-PCR产物的测序结果 | 第63页 |
| ·荧光定量RT-PCR条件的优化 | 第63-65页 |
| ·Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR引物浓度的优化 | 第63-64页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR引物和探针浓度的优化 | 第64-65页 |
| ·最佳Tm温度的优化 | 第65页 |
| ·常规PCR检测标准品的结果 | 第65-66页 |
| ·Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR检测的结果 | 第66-69页 |
| ·Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR敏感性检测结果及标准曲线的生成 | 第66-67页 |
| ·Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR特异性检测结果 | 第67-68页 |
| ·Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR重复性检测结果 | 第68-69页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR检测的结果 | 第69-73页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR敏感性检测结果及标准曲线的生成 | 第69-70页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR特异性检测结果 | 第70-71页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR重复性检测结果 | 第71-73页 |
| ·三种方法检测结果的比较 | 第73页 |
| 4.讨论 | 第73-77页 |
| ·Nsp2基因 | 第73-74页 |
| ·Nsp2基因序列的扩增 | 第73页 |
| ·Nsp2基因的变异 | 第73-74页 |
| ·cDNA序列的生物信息学分析方法 | 第74页 |
| ·荧光定量PCR的背景和建立 | 第74-76页 |
| ·Power SYBR Green RT-PCR | 第75页 |
| ·TaqMan RT-PCR | 第75-76页 |
| ·质粒标准品与标准曲线 | 第76-77页 |
| ·质粒标准品 | 第76页 |
| ·标准曲线 | 第76-77页 |
| 5.小结 | 第77-78页 |
| 第三章 荧光定量RT-PCR对病料样品的检测 | 第78-86页 |
| 1.材料 | 第78页 |
| ·病料样品 | 第78页 |
| ·主要试剂及配制 | 第78页 |
| ·主要仪器设备 | 第78页 |
| 2.实验方法 | 第78-80页 |
| ·病料样品的采集 | 第78页 |
| ·病料样品的处理 | 第78-79页 |
| ·反转录的反应体系 | 第79页 |
| ·对病料样品的检测 | 第79-80页 |
| ·标准阳性模板的制备 | 第79-80页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR对病料样品的检测 | 第80页 |
| ·几种检测方法的比较 | 第80页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR对病料样品的重复性检测 | 第80页 |
| 3.结果 | 第80-83页 |
| ·对病料样品的检测 | 第80-81页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR对病料样品的检测结果 | 第80-81页 |
| ·检测试剂盒对病料样品的检测结果 | 第81页 |
| ·几种检测方法的比较 | 第81-83页 |
| ·Nsp2-TaqMan RT-PCR对病料样品的重复性检测 | 第83页 |
| 4.讨论 | 第83-85页 |
| ·高质量RNA的获得 | 第83-84页 |
| ·数据分析 | 第84页 |
| ·本实验摸索TaqMan RT-PCR检测的质控标准 | 第84页 |
| ·对于污染的监测 | 第84-85页 |
| 5.小结 | 第85-86页 |
| 结论 | 第86-87页 |
| 本论文创新点 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-96页 |
| 附录一 重组质粒的测序结果 | 第96-97页 |
| 附录二 荧光定量RT-PCR扩增产物测序结果 | 第97-100页 |
| 附录三 Nsp2基因编码蛋白质比对结果 | 第100-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第103页 |
