| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1、前言 | 第13-25页 |
| 1.1.线虫概述 | 第13-16页 |
| 1.1.1.植物寄生线虫的种类、危害与防治 | 第13-14页 |
| 1.1.2.秀丽隐杆线虫简介 | 第14-15页 |
| 1.1.3.根结线虫简介 | 第15-16页 |
| 1.2.线虫致病细菌概述 | 第16-18页 |
| 1.2.1.巴氏杆菌简介 | 第16-17页 |
| 1.2.2.芽胞杆菌简介 | 第17页 |
| 1.2.3.假单胞菌简介 | 第17-18页 |
| 1.3.线虫致病真菌概述 | 第18-19页 |
| 1.4.丁香假单胞菌MB03简介 | 第19页 |
| 1.5.杀线虫毒力因子概述 | 第19-22页 |
| 1.5.1.蛋白酶类 | 第20-21页 |
| 1.5.2.Rhs家族蛋白 | 第21-22页 |
| 1.5.3.小分子化合物 | 第22页 |
| 1.6.侵染线虫分子机制研究 | 第22-23页 |
| 1.7.研究目的及意义 | 第23-25页 |
| 2、材料与方法 | 第25-40页 |
| 2.1.实验材料与仪器 | 第25-32页 |
| 2.1.1.菌株与质粒 | 第25-27页 |
| 2.1.2.引物设计 | 第27页 |
| 2.1.3.生测对象 | 第27页 |
| 2.1.4.实验试剂及配制 | 第27-31页 |
| 2.1.4.1.培养基 | 第27-28页 |
| 2.1.4.2.质粒抽提、感受态细胞制备与快检 | 第28页 |
| 2.1.4.3.PCR、酶切、酶连及琼脂糖凝胶电泳 | 第28-29页 |
| 2.1.4.4.外源蛋白的诱导与纯化 | 第29-30页 |
| 2.1.4.5.以秀丽隐杆线虫为试虫的生物活性测定试剂 | 第30页 |
| 2.1.4.6.荧光观察所用试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.5.主要仪器设备 | 第31-32页 |
| 2.2.实验方法 | 第32-40页 |
| 2.2.1.技术路线 | 第32-33页 |
| 2.2.2.分子生物学操作 | 第33-34页 |
| 2.2.2.1.PCR扩增 | 第33页 |
| 2.2.2.2.大肠杆菌质粒的抽提 | 第33页 |
| 2.2.2.3.DNA的体外重组 | 第33-34页 |
| 2.2.2.4.大肠杆菌的CaCl_2法转化 | 第34页 |
| 2.2.2.5.转化子质粒的快速检测 | 第34页 |
| 2.2.3.工程菌的诱导表达与亲和纯化 | 第34-35页 |
| 2.2.3.1.工程菌的诱导表达 | 第34页 |
| 2.2.3.2.SDS-PAGE样品制备和聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第34页 |
| 2.2.3.3.镍柱亲和纯化目的蛋白 | 第34-35页 |
| 2.2.3.4.透析目的蛋白 | 第35页 |
| 2.2.3.5.蛋白浓度测定 | 第35页 |
| 2.2.4.丝氨酸蛋白酶活性测定 | 第35-36页 |
| 2.2.5.秀丽隐杆线虫的饲养与同步化 | 第36页 |
| 2.2.5.1.秀丽隐杆线虫的饲养 | 第36页 |
| 2.2.5.2.秀丽隐杆线虫的裂解与同步化 | 第36页 |
| 2.2.6.以秀丽隐杆线虫为试虫的生物活性测定 | 第36-38页 |
| 2.2.6.1.重组菌秀丽隐杆线虫生测试验 | 第36-37页 |
| 2.2.6.2.纯化蛋白生测试验中LC_(50)值和LT_(50)值的测定 | 第37页 |
| 2.2.6.3.L1期线虫生长抑制试验 | 第37页 |
| 2.2.6.4.影响线虫产卵率实验 | 第37-38页 |
| 2.2.6.5.影响线虫运动性实验 | 第38页 |
| 2.2.7.荧光显微观察 | 第38-39页 |
| 2.2.8.线虫病理观察 | 第39页 |
| 2.2.9.以南方根结线虫线虫为试虫的生物活性测定 | 第39-40页 |
| 3、结果与讨论 | 第40-71页 |
| 3.1.PSEUDOMONAS SYRINGAE MB03中杀线虫毒性基因的筛选 | 第40-43页 |
| 3.1.1.利用Virlent Pred毒性蛋白数据库进行筛选 | 第40-41页 |
| 3.1.2.通过查阅文献与BLAST P相结合的方法进行筛选 | 第41-43页 |
| 3.2.目的基因的原核表达 | 第43-50页 |
| 3.2.1.重组质粒的构建 | 第43-47页 |
| 3.2.2.重组菌的诱导表达 | 第47-50页 |
| 3.3.重组菌对秀丽隐杆线虫活性的影响 | 第50-52页 |
| 3.4.疑似杀线虫蛋白保守结构域及功能分析 | 第52-54页 |
| 3.5.蛋白的纯化及纯化蛋白对秀丽隐杆线虫活性的影响 | 第54-71页 |
| 3.5.1.目的蛋白亲和层析纯化结果 | 第54-55页 |
| 3.5.2.2-甲基乌头酸异构酶对线虫的生物活性测定 | 第55-63页 |
| 3.5.2.1.对线虫LC_(50)值的测定 | 第55-56页 |
| 3.5.2.2.对线虫LT_(50)值的测定 | 第56-57页 |
| 3.5.2.3.L1期线虫生长抑制实验 | 第57-58页 |
| 3.5.2.4.线虫产卵率影响实验 | 第58-59页 |
| 3.5.2.5.线虫运动性影响实验 | 第59-60页 |
| 3.5.2.6.线虫荧光显微镜观察 | 第60-61页 |
| 3.5.2.7.线虫病理观察 | 第61-62页 |
| 3.5.2.8.对南方根结线虫的毒性测定 | 第62-63页 |
| 3.5.3.中性锌金属蛋白酶及Rhs家族蛋白对线虫的生物活性分析 | 第63-71页 |
| 3.5.3.1.对线虫LC_(50)值的测定 | 第63-65页 |
| 3.5.3.2.对线虫LT_(50)值的测定 | 第65-66页 |
| 3.5.3.3.L1期线虫生长抑制实验 | 第66-67页 |
| 3.5.3.4.线虫产卵率影响实验 | 第67-68页 |
| 3.5.3.5.线虫运动性影响实验 | 第68-69页 |
| 3.5.3.6.对南方根结线虫的毒性测定 | 第69-71页 |
| 4、小结与讨论 | 第71-75页 |
| 4.1.小结 | 第71-72页 |
| 4.2.讨论 | 第72-75页 |
| 4.2.1.丁香假单胞菌MB03杀线虫毒性因子筛选方法讨论 | 第72-73页 |
| 4.2.2.纯蛋白对秀丽隐杆线虫生物活性测定讨论 | 第73页 |
| 4.2.3.2-甲基乌头酸异构酶杀线虫机制讨论 | 第73-74页 |
| 4.2.4.研究展望 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-82页 |
| 附录 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
