| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 符号说明 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-21页 |
| 1 RNA甲基化 | 第12-13页 |
| 1.1 RNA甲基化 | 第12页 |
| 1.2 RNA甲基化酶(RNA-MTases) | 第12-13页 |
| 1.3 N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A) | 第13页 |
| 2 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5C) | 第13-16页 |
| 2.1 5-甲基胞嘧啶(m5C) | 第13-14页 |
| 2.2 RNAs中m5C检测的方法 | 第14页 |
| 2.3 5-甲基胞嘧啶甲基转移酶(m5C-MTase)以及去甲基化酶 | 第14-15页 |
| 2.4 m5C在不同细胞RNA中分布以及生物学意义 | 第15-16页 |
| 3 RNA甲基化酶TRDMT1 | 第16-17页 |
| 3.1 TRDMT1的进化以及结构 | 第16页 |
| 3.2 TRDMT1对tRNA甲基化的影响 | 第16-17页 |
| 3.3 TRDMT1酶的表达和调控 | 第17页 |
| 4 CRISPR/Cas9系统 | 第17-20页 |
| 4.1 CRISPR/Cas9系统的由来 | 第17-18页 |
| 4.2 CRISPR/Cas9系统的结构和作用机制 | 第18-19页 |
| 4.3 CRISPR/Cas9系统的应用和发展 | 第19-20页 |
| 5 研究目的与意义 | 第20-21页 |
| 第二章 RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的细胞系建立 | 第21-36页 |
| 前言 | 第21页 |
| 1 材料 | 第21-24页 |
| 1.1 实验材料 | 第21-22页 |
| 1.2 主要试剂 | 第22页 |
| 1.3 主要仪器 | 第22-23页 |
| 1.4 主要试剂的配制 | 第23页 |
| 1.5 相关引物的合成 | 第23-24页 |
| 2 实验方法 | 第24-32页 |
| 2.1 构建TRDMT1-gRNA载体 | 第24-26页 |
| 2.2 构建TRDMT1-LOXN-Puro同源重组载体 | 第26-29页 |
| 2.3 构建TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体 | 第29-30页 |
| 2.4 转染HEK293细胞 | 第30页 |
| 2.5 筛选并获得TRDMT1基因去表达的稳定细胞株 | 第30-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-34页 |
| 3.1 成功构建TRDMT1-gRNA载体 | 第32页 |
| 3.2 同源重组载体鉴定 | 第32-33页 |
| 3.3 RNA甲基化酶TRDMT1基因转录水平检测 | 第33-34页 |
| 4 讨论 | 第34-35页 |
| 5 小结 | 第35-36页 |
| 第三章 TRDMT1基因敲除与恢复对细胞表型的影响 | 第36-52页 |
| 前言 | 第36页 |
| 1 材料 | 第36-39页 |
| 1.1 实验材料 | 第36页 |
| 1.2 主要试剂 | 第36-37页 |
| 1.3 主要仪器 | 第37-38页 |
| 1.4 主要试剂的配制 | 第38-39页 |
| 2 实验方法 | 第39-45页 |
| 2.1 细胞周期观察 | 第39-40页 |
| 2.2 细胞生长曲线观察 | 第40页 |
| 2.3 细胞划痕观察 | 第40-41页 |
| 2.4 单克隆形成观察 | 第41-42页 |
| 2.5 构建TRDMT1基因过表达载体pcDNA3.1-TRDMT1 | 第42-43页 |
| 2.6 瞬时转染HEK293和HEK293-TKO细胞 | 第43-44页 |
| 2.7 荧光定量PCR检测TRDMT1 mRNA水平变化 | 第44页 |
| 2.8 细胞生长曲线实验 | 第44-45页 |
| 2.9 细胞划痕实验 | 第45页 |
| 3 结果 | 第45-50页 |
| 3.1 TRDMT1敲除影响HEK293细胞周期 | 第45-46页 |
| 3.2 TRDMT1基因敲除抑制HEK293细胞增殖 | 第46-47页 |
| 3.3 TRDMT1基因敲除抑制HEK293细胞迁移 | 第47页 |
| 3.4 TRDMT1基因敲除不能显著影响HEK293细胞克隆形成能力 | 第47-48页 |
| 3.5 成功构建pcDNA3.1 (+)-TRDMT1过表达载体 | 第48页 |
| 3.6 TRDMT1基因过表达检测 | 第48-49页 |
| 3.7 恢复TRDMT1表达促进细胞增殖 | 第49-50页 |
| 3.8 恢复TRDMT1基因表达促进细胞迁移 | 第50页 |
| 4 讨论 | 第50-51页 |
| 5 小结 | 第51-52页 |
| 第四章 TRDMT1基因敲除对基因表达谱的影响 | 第52-66页 |
| 前言 | 第52页 |
| 1 材料 | 第52-54页 |
| 1.1 实验材料 | 第52-53页 |
| 1.2 主要试剂 | 第53页 |
| 1.3 主要仪器 | 第53-54页 |
| 1.4 主要试剂的配制 | 第54页 |
| 2 实验方法 | 第54-59页 |
| 2.1 转录组高通量测序(transcriptome sequencing)与分析 | 第54-56页 |
| 2.2 在HEK293和HEK293-TKO细胞验证转录组测序结果 | 第56-57页 |
| 2.3 在TRDMT1基因敲除型斑马鱼中验证3个差异基因的表达 | 第57-59页 |
| 3 结果 | 第59-63页 |
| 3.1 差异表达基因筛选 | 第59页 |
| 3.2 差异表达基因聚类分析 | 第59-60页 |
| 3.3 差异基因GO富集分析 | 第60页 |
| 3.4 差异基因KEGG富集分析 | 第60-61页 |
| 3.5 差异基因在HEK293细胞中的验证 | 第61-62页 |
| 3.6 三个差异表达基因在斑马鱼中的验证 | 第62-63页 |
| 4 讨论 | 第63-65页 |
| 5 小结 | 第65-66页 |
| 全文总结 | 第66-67页 |
| 创新性 | 第67页 |
| 研究展望 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第77-78页 |
