| 摘要 | 第4-7页 |
| abstract | 第7-9页 |
| 第1章 引言 | 第12-25页 |
| 1.1 MicroRNAs的概述 | 第12-14页 |
| 1.1.1 MicroRNAs的特征 | 第12页 |
| 1.1.2 MicroRNAs的发现 | 第12页 |
| 1.1.3 MicroRNAs的生物合成过程 | 第12-13页 |
| 1.1.4 MicroRNAs的生物学作用及机制 | 第13页 |
| 1.1.5 MicroRNAs的生物学功能 | 第13-14页 |
| 1.2 性发育与GnRH | 第14-16页 |
| 1.2.1 性发育 | 第14-15页 |
| 1.2.2 下丘脑和GnRH | 第15-16页 |
| 1.3 调控GnRH启动的新机制：microRNA | 第16-21页 |
| 1.3.1 GnRH研究进展 | 第17页 |
| 1.3.2 microRNAs与GnRH | 第17页 |
| 1.3.3 CRISPR-Cas9技术 | 第17-19页 |
| 1.3.4 双荧光素酶报告系统检测技术 | 第19-21页 |
| 1.4 研究背景 | 第21-22页 |
| 1.4.1 miRNAs | 第21页 |
| 1.4.2 microRNA与性发育 | 第21-22页 |
| 1.5 研究内容 | 第22-23页 |
| 1.6 研究意义 | 第23-25页 |
| 第2章 材料与方法 | 第25-45页 |
| 2.1 材料 | 第25-27页 |
| 2.1.1 生物材料 | 第25页 |
| 2.1.2 实验仪器与试剂 | 第25-27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-43页 |
| 2.2.1 sgRNA表达载体的构建 | 第27-31页 |
| 2.2.2 pGnRH-2A-EGFP表达载体的构建 | 第31-33页 |
| 2.2.3 GnRH的3’UTR表达载体的构建 | 第33-37页 |
| 2.2.4 T7E1assay检测剪切效率 | 第37-38页 |
| 2.2.5 细胞培养 | 第38-40页 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR | 第40-43页 |
| 2.3 数据分析 | 第43-45页 |
| 第3章 结果与分析 | 第45-66页 |
| 3.1 mmu-sgRNA-GnRH的设计 | 第45页 |
| 3.2 sgRNA表达载体的构建 | 第45-47页 |
| 3.2.1 42230 -sgRNA载体的构建 | 第45-47页 |
| 3.3 pGnRH-2A-EGFP打靶载体的构建 | 第47-53页 |
| 3.3.1 2A-EGFP打靶载体的构建 | 第47-49页 |
| 3.3.2 GnRH基因的5’arm-2A-EGFP打靶载体的构建 | 第49-51页 |
| 3.3.3 pGnRH-2A-EGFP打靶载体的构建 | 第51-53页 |
| 3.4 流式检测 | 第53-54页 |
| 3.5 GnRH的3’UTR表达载体的构建 | 第54-57页 |
| 3.5.1 数据库预测GnRH上miRNA结合位点 | 第54-55页 |
| 3.5.2 野生型3’UTR的形成 | 第55页 |
| 3.5.3 psi-check-2线性化载体的形成 | 第55页 |
| 3.5.4 构建psi-check-2-3’UTR载体 | 第55-56页 |
| 3.5.5 DNA测序鉴定 | 第56-57页 |
| 3.6 miRNA在293细胞中的有效性筛选 | 第57-60页 |
| 3.6.1 miRNA在293细胞中梯度转染图 | 第57页 |
| 3.6.2 miRNA在293细胞中有效性筛选 | 第57-60页 |
| 3.7 在GT1-7细胞中miRNA靶向GnRH的有效性验证 | 第60-66页 |
| 3.7.1 在GT1-7细胞中荧光素酶活性验证 | 第60页 |
| 3.7.2 在GT1-7细胞中GnRH表达量检测 | 第60-63页 |
| 3.7.3 在GT1-7细胞中性发育相关基因表达量的检测 | 第63-66页 |
| 第4章 讨论 | 第66-68页 |
| 4.1 GnRH表达调控报告系统的优势 | 第66页 |
| 4.2 流式细胞仪分选单克隆细胞 | 第66-67页 |
| 4.3 CRISPR/Cas9的优势特点 | 第67页 |
| 4.4 靶向GnRH基因的miRNA的协同调控模式 | 第67-68页 |
| 第5章 结论和展望 | 第68-70页 |
| 5.1 结论 | 第68-69页 |
| 5.2 展望 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-77页 |
| 课题来源 | 第77-78页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文目录 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
