| 符号说明 | 第4-10页 |
| 中文摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 引言 | 第13-27页 |
| 1.1 呼肠孤病毒概述 | 第13-14页 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒血清型 | 第14页 |
| 1.3 新型番鸭呼肠孤病毒（N-MDRV） | 第14-15页 |
| 1.4 N-MDRV 病毒特征 | 第15-17页 |
| 1.5 N-MDRV 病毒培养 | 第17页 |
| 1.6 N-MDRV 表达的主要蛋白 | 第17-22页 |
| 1.7 N-MDRV 与 MDRV 感染引起的病理变化比较 | 第22-23页 |
| 1.8 禽呼肠孤病毒病检测方法 | 第23-25页 |
| 1.8.1 血清学检测 | 第24页 |
| 1.8.2 分子生物学检测 | 第24-25页 |
| 1.9 番鸭呼肠孤病毒疫苗研究 | 第25-26页 |
| 1.9.1 灭活苗 | 第25页 |
| 1.9.2 活疫苗（弱毒苗） | 第25页 |
| 1.9.3 基因工程苗 | 第25-26页 |
| 1.10 MDRV σ C 基因研究进展 | 第26-27页 |
| 1.11 本研究的目的与意义 | 第27页 |
| 2 实验材料与方法 | 第27-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-28页 |
| 2.1.1 菌株与试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.2 实验动物 | 第28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-35页 |
| 2.2.1 引物设计与合成 | 第28页 |
| 2.2.2 N-MDRV 培养 | 第28页 |
| 2.2.3 病毒模板的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.4 RT-PCR 扩增 N-MDRV σC 基因 | 第29页 |
| 2.2.5 重组克隆载体的构建与鉴定 | 第29-32页 |
| 2.2.5.1 N-MDRV σC 基因的回收与纯化 | 第29-30页 |
| 2.2.5.2 N-MDRV σC 基因的克隆与鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.5.3 重组质粒的序列测定与序列分析 | 第31页 |
| 2.2.5.4 原核表达载体 pET28a-σC 的构建与鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.6 重组σC 蛋白的表达与鉴定 | 第32-35页 |
| 2.2.6.1 重组σC 蛋白的初步表达鉴定 | 第32页 |
| 2.2.6.2 IPTG 最佳诱导浓度的确定 | 第32-33页 |
| 2.2.6.3 IPTG 最佳诱导时间的确定 | 第33页 |
| 2.2.6.4 重组σC 蛋白细胞定位分析 | 第33-35页 |
| 2.3 重组σC 蛋白免疫印记分析（Western Blot） | 第35-36页 |
| 2.3.1 SDS-PAGE 电泳 | 第35页 |
| 2.3.2 Western Blot 过程 | 第35-36页 |
| 2.4 重组σC 蛋白间接免疫荧光分析（IFA） | 第36页 |
| 2.5 间接 ELISA 检测方法的建立 | 第36-38页 |
| 2.5.1 间接 ELISA 反应条件的优化 | 第37页 |
| 2.5.1.1 封闭液的选择 | 第37页 |
| 2.5.1.2 抗原包被浓度与血清稀释度的选择 | 第37页 |
| 2.5.1.3 一抗血清最佳作用时间的选择 | 第37页 |
| 2.5.1.4 酶标二抗最佳作用时间的选择 | 第37页 |
| 2.5.2 间接 ELISA 检测方法阴阳性临界值的确定 | 第37页 |
| 2.5.3 间接 ELISA 检测方法重复性实验 | 第37-38页 |
| 2.5.4 间接 ELISA 检测方法敏感性实验 | 第38页 |
| 2.5.5 间接 ELISA 检测方法特异性实验 | 第38页 |
| 2.5.6 临床样品的检测 | 第38页 |
| 3 实验结果 | 第38-49页 |
| 3.1 RT-PCR 结果 | 第38-39页 |
| 3.2 重组质粒的鉴定 | 第39-40页 |
| 3.2.1 重组质粒 pMD-18T-σC 的鉴定 | 第39页 |
| 3.2.2 重组质粒 pET-28a-σC 的鉴定 | 第39-40页 |
| 3.3 重组σC 蛋白在大肠杆菌中的表达分析 | 第40-43页 |
| 3.3.1 重组 pET-28a-σC 质粒转化进 E.coli BL21（DE3）后的鉴定分析 | 第40页 |
| 3.3.2 重组σC 蛋白的初步表达鉴定 | 第40-41页 |
| 3.3.3 重组σC 蛋白诱导表达条件优化 | 第41-43页 |
| 3.3.3.1 重组σC 蛋白诱导表达 IPTG 最佳浓度的优化 | 第41-42页 |
| 3.3.3.2 重组σC 蛋白诱导最佳时间的优化 | 第42页 |
| 3.3.3.3 重组σC 表达蛋白细胞定位分析 | 第42页 |
| 3.3.3.4 重组σC 表达蛋白亲和层析纯化与切胶纯化比较 | 第42-43页 |
| 3.4 重组σC 表达蛋白免疫印记分析（Western Blot） | 第43页 |
| 3.5 重组σC 表达蛋白间接免疫荧光分析（IFA） | 第43-44页 |
| 3.6 间接 ELISA 反应条件的优化 | 第44-47页 |
| 3.6.1 封闭液的选择 | 第44-45页 |
| 3.6.2 蛋白最适包被浓度与血清稀释度的确定 | 第45页 |
| 3.6.3 酶标二抗最佳工作浓度的确定 | 第45-46页 |
| 3.6.4 血清与二抗最佳反应时间的确定 | 第46页 |
| 3.6.5 间接 ELISA 检测方法阴阳性临界值的确定 | 第46-47页 |
| 3.7 间接 ELISA 检测方法重复性实验 | 第47-48页 |
| 3.7.1 批内重复性实验 | 第47页 |
| 3.7.2 批间重复性实验 | 第47-48页 |
| 3.8 间接 ELISA 检测方法敏感性实验 | 第48页 |
| 3.9 间接 ELISA 检测方法特异性实验 | 第48-49页 |
| 3.10 临床样品的检测 | 第49页 |
| 4 讨论 | 第49-52页 |
| 4.1 目的基因的选择 | 第49-50页 |
| 4.2 N-MDRV σC 蛋白基因的融合表达 | 第50页 |
| 4.3 N-MDRV σC 蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| 4.4 N-MDRV σC 蛋白抗原特性分析 | 第51-52页 |
| 4.5 间接 ELISA 检测方法分析 | 第52页 |
| 5 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 作者简介及硕士期间发表论文情况 | 第59-60页 |
| 附录 | 第60-61页 |
