| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 前言 | 第11-19页 |
| 一、真菌细胞壁结构的研究进展 | 第11-12页 |
| 二、真菌菌柄细胞壁伸长的研究进展 | 第12-14页 |
| 三、真菌几丁质酶和内切葡聚糖酶的异源重组研究概况 | 第14-17页 |
| 1. 真菌几丁质酶的异源重组研究进展 | 第14-15页 |
| 2. 真菌内切葡聚糖酶的异源重组研究进展 | 第15页 |
| 3. 大肠杆菌表达系统 | 第15-16页 |
| 4. 酵母表达系统 | 第16-17页 |
| 四、本论文的研究目的及意义 | 第17-19页 |
| 第二章 灰盖鬼伞内切几丁质酶基因的克隆及表达 | 第19-48页 |
| 第一节 灰盖鬼伞内切几丁质酶基因的克隆 | 第19-30页 |
| 1 材料与方法 | 第19-27页 |
| 1.1 实验材料 | 第19-21页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第19页 |
| 1.1.2 培养基的配制 | 第19页 |
| 1.1.3 主要试剂及来源 | 第19-20页 |
| 1.1.4 主要仪器设备及其来源 | 第20页 |
| 1.1.5 主要溶液配制 | 第20-21页 |
| 1.1.6 PCR引物 | 第21页 |
| 1.2 实验方法 | 第21-27页 |
| 1.2.1 灰盖鬼伞的培养方法 | 第21页 |
| 1.2.2 灰盖鬼伞总RNA的提取 | 第21-22页 |
| 1.2.3 RT-PCR方法合成灰盖鬼伞cDNA | 第22-23页 |
| 1.2.4 设计引物进行PCR扩增 | 第23-25页 |
| 1.2.5 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 | 第25页 |
| 1.2.6 PCR产物纯化回收 | 第25页 |
| 1.2.7 PCR产物装TA克隆 | 第25页 |
| 1.2.8 CaCl_2法制备感受态细胞 | 第25页 |
| 1.2.9 感受态细胞的热休克转化和稀释涂布 | 第25-26页 |
| 1.2.10 克隆载体的阳性筛选 | 第26-27页 |
| 2 实验结果 | 第27-29页 |
| 2.1 灰盖鬼伞总RNA的提取 | 第27页 |
| 2.2 PCR结果 | 第27-28页 |
| 2.3 阳性克隆的筛选 | 第28-29页 |
| 2.4 测序及序列比对结果 | 第29页 |
| 3 讨论 | 第29-30页 |
| 第二节 灰盖鬼伞内切几丁质酶的原核异源重组表达 | 第30-41页 |
| 1 材料与方法 | 第30-36页 |
| 1.1 实验材料 | 第30-32页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第30页 |
| 1.1.2 培养基的配制 | 第30页 |
| 1.1.3 主要试剂及来源 | 第30-31页 |
| 1.1.4 主要仪器设备及其来源 | 第31-32页 |
| 1.1.5 主要溶液配制 | 第32页 |
| 1.2 实验方法 | 第32-36页 |
| 1.2.1 含特定粘性末端的DNA片段和PET28a载体的制备 | 第32-33页 |
| 1.2.2 DNA连接反应 | 第33页 |
| 1.2.3 连接产物化转导入DH5α感受态细胞 | 第33页 |
| 1.2.4 重组菌的筛选和鉴定 | 第33-34页 |
| 1.2.5 重组菌的诱导表达 | 第34-35页 |
| 1.2.6 粗蛋白的制备 | 第35页 |
| 1.2.7 DNS法测内切几丁质酶的水解酶活性 | 第35页 |
| 1.2.8 SDS-PAGE检测蛋白表达 | 第35-36页 |
| 2 实验结果 | 第36-40页 |
| 2.1 双酶切克隆载体和表达载体制备含特定粘性末端片段的结果 | 第36-37页 |
| 2.2 重组菌阳性克隆筛选的结果 | 第37-38页 |
| 2.3 内切几丁质酶在E.coli中的重组表达 | 第38-39页 |
| 2.4 重组表达后内切几丁质酶的活性测定 | 第39-40页 |
| 3. 讨论 | 第40-41页 |
| 第三节 灰盖鬼伞内切几丁质酶的真核异源重组表达菌株的构建 | 第41-48页 |
| 1 材料与方法 | 第41-45页 |
| 1.1 实验材料 | 第41-43页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第41页 |
| 1.1.2 培养基的配制 | 第41-42页 |
| 1.1.3 主要试剂及来源 | 第42页 |
| 1.1.4 主要仪器设备及来源 | 第42-43页 |
| 1.2 实验方法 | 第43-45页 |
| 1.2.1 含特定粘性末端的DNA片段和PESP-3载体的制备 | 第43页 |
| 1.2.2 DNA连接反应 | 第43页 |
| 1.2.3 连接产物化转导入表达菌株DH10B感受态细胞 | 第43-44页 |
| 1.2.4 LiAc法制备酵母SP-Q01感受态细胞 | 第44页 |
| 1.2.5 SP-Q01感受态细胞的醋酸锂热激转化 | 第44-45页 |
| 1.2.6 重组菌的筛选和鉴定 | 第45页 |
| 2 实验结果 | 第45-46页 |
| 2.1 双酶切克隆载体和表达载体制备含特定粘性末端片段的结果 | 第45-46页 |
| 2.2 重组菌阳性克隆筛选的结果 | 第46页 |
| 3 讨论 | 第46-48页 |
| 第三章 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶基因的克隆及表达 | 第48-72页 |
| 第一节 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶基因的克隆 | 第48-59页 |
| 1 材料与方法 | 第48-55页 |
| 1.1 实验材料 | 第48-49页 |
| 1.1.1 PCR引物 | 第48-49页 |
| 1.1.2 酶和试剂盒 | 第49页 |
| 1.1.3 菌株培养与保藏 | 第49页 |
| 1.1.4 培养基的配制 | 第49页 |
| 1.1.5 主要仪器和试剂及其来源 | 第49页 |
| 1.1.6 主要溶液配制 | 第49页 |
| 1.2 实验方法 | 第49-55页 |
| 1.2.1 灰盖鬼伞基因组DNA的提取 | 第49-50页 |
| 1.2.2 设计引物进行PCR扩增 | 第50-53页 |
| 1.2.3 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 | 第53页 |
| 1.2.4 PCR产物纯化回收 | 第53页 |
| 1.2.5 平末端克隆连接 | 第53-54页 |
| 1.2.6 PCR产物装TA克隆 | 第54页 |
| 1.2.7 CaCl2法制备感受态细胞 | 第54页 |
| 1.2.8 感受态细胞的热休克转化和稀释涂布 | 第54页 |
| 1.2.9 克隆载体的阳性筛选 | 第54-55页 |
| 2 实验结果 | 第55-57页 |
| 2.1 PCR结果 | 第55-56页 |
| 2.2 阳性克隆的筛选结果 | 第56-57页 |
| 2.3 测序及序列比对结果 | 第57页 |
| 3 讨论 | 第57-59页 |
| 第二节 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶的原核异源重组表达 | 第59-65页 |
| 1 材料与方法 | 第59-60页 |
| 1.1 实验材料 | 第59页 |
| 1.2 实验方法 | 第59-60页 |
| 1.2.1 含特定粘性末端的DNA片段和PET28a载体的制备 | 第59页 |
| 1.2.2 DNA连接反应 | 第59-60页 |
| 1.2.3 连接产物化转导入表达菌株DH5 α感受态细胞 | 第60页 |
| 1.2.4 重组菌的筛选和鉴定 | 第60页 |
| 1.2.5 重组菌的诱导表达 | 第60页 |
| 1.2.6 粗蛋白的制备 | 第60页 |
| 1.2.7 DNS法测内切葡聚糖水解酶活性 | 第60页 |
| 1.2.8 SDS-PAGE检测蛋白表达 | 第60页 |
| 2 实验结果 | 第60-63页 |
| 2.1 双酶切克隆载体和表达载体制备含特定粘性末端片段的结果 | 第60-61页 |
| 2.2 重组菌阳性克隆筛选的结果 | 第61-62页 |
| 2.3 内切葡聚糖酶在E.coli中的重组表达 | 第62-63页 |
| 3 讨论 | 第63-65页 |
| 第三节 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶稀有密码子分析 | 第65-67页 |
| 第四节 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶的真核异源重组表达菌株的构建 | 第67-72页 |
| 1 材料与方法 | 第67-69页 |
| 1.1 实验方法 | 第67页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第67页 |
| 1.1.2 培养基的配制 | 第67页 |
| 1.1.3 主要试剂及来源 | 第67页 |
| 1.1.4 主要仪器设备及来源 | 第67页 |
| 1.2 实验方法 | 第67-69页 |
| 1.2.1 含特定粘性末端的DNA片段和PESP-3载体的制备 | 第67-68页 |
| 1.2.2 DNA连接反应 | 第68页 |
| 1.2.3 连接产物化转导入表达菌株DH10B感受态细胞 | 第68页 |
| 1.2.4 LiAc法制备酵母SP-Q01感受态细胞 | 第68页 |
| 1.2.5 SP-Q01感受态细胞的醋酸锂热激转化 | 第68-69页 |
| 1.2.6 重组菌的筛选和鉴定 | 第69页 |
| 2 实验结果 | 第69-71页 |
| 2.1 双酶切克隆载体和表达载体制备含特定粘性末端片段的结果 | 第69-70页 |
| 2.2 重组菌阳性克隆筛选的结果 | 第70-71页 |
| 3 讨论 | 第71-72页 |
| 总结 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-78页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
