| 缩略语 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 综述 | 第9-16页 |
| 1.1 米曲霉中性蛋白酶 | 第9-10页 |
| 1.1.1 米曲霉 | 第9页 |
| 1.1.2 中性蛋白酶 | 第9-10页 |
| 1.2 重组中性蛋白酶I的真核表达 | 第10-11页 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统 | 第10页 |
| 1.2.2 重组蛋白糖基化的研究 | 第10-11页 |
| 1.3 定向进化在酶最适pH改造中的应用 | 第11页 |
| 1.4 曲霉属真菌转化系统及发酵表达 | 第11-15页 |
| 1.4.1 曲霉属真菌转化方法 | 第12页 |
| 1.4.2 转化子的筛选 | 第12-14页 |
| 1.4.3 曲霉属的固态发酵 | 第14-15页 |
| 1.5 主要研究内容 | 第15-16页 |
| 第二章 米曲霉重组中性蛋白酶的糖基化对酶活的影响 | 第16-36页 |
| 2.1 引言 | 第16页 |
| 2.2 材料 | 第16-18页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第16页 |
| 2.2.2 设备仪器 | 第16-17页 |
| 2.2.3 生化试剂 | 第17页 |
| 2.2.4 主要试剂和溶液 | 第17-18页 |
| 2.3 方法 | 第18-25页 |
| 2.3.1 蛋白三维模型的构建 | 第18-19页 |
| 2.3.2 增加糖基化位点引物设计 | 第19页 |
| 2.3.3 定点突变表达载体pPIC9K-NPⅠ-P56Y-6His、pPIC9K-NPⅠ-N41AP56Y-6His的构建 | 第19-21页 |
| 2.3.4 突变表达载体pPIC9K-NPⅠ-P56Y-6His、pPIC9K-NPⅠ-N41AP56Y-6His的转化与鉴定 | 第21-22页 |
| 2.3.5 重组质粒pPIC9K-NPⅠ-N41AP56Y-6His、pPIC9K-NPⅠ-P56Y-6His转化毕赤酵母GS115 | 第22-23页 |
| 2.3.6 重组中性蛋白酶的摇瓶诱导表达 | 第23-25页 |
| 2.3.7 突变酶rNPⅠ-P56Y、rNPⅠ-N41AP56Y的纯化分析 | 第25页 |
| 2.4 结果与分析 | 第25-34页 |
| 2.4.1 中性蛋白酶I的三维结构模拟 | 第25-27页 |
| 2.4.2 表达载体的构建 | 第27-29页 |
| 2.4.3 酵母重组子的表型鉴定 | 第29-30页 |
| 2.4.4 酵母突变子的摇瓶表达 | 第30-31页 |
| 2.4.5 重组酶的纯化分析 | 第31-32页 |
| 2.4.6 突变酶酶活及热稳定性的测定 | 第32-34页 |
| 2.5 讨论 | 第34-35页 |
| 2.6 小结 | 第35-36页 |
| 第三章 体外筛选最适pH降低的中性蛋白酶基因在米曲霉中的表达 | 第36-54页 |
| 3.1 引言 | 第36页 |
| 3.2 材料 | 第36-40页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第36-37页 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 | 第37页 |
| 3.2.3 生化试剂 | 第37页 |
| 3.2.4 溶液与培养基 | 第37-40页 |
| 3.2.4.1 培养基 | 第37-38页 |
| 3.2.4.2 主要试剂溶液 | 第38-40页 |
| 3.3 方法 | 第40-46页 |
| 3.3.1 引入突变位点和添加组氨酸标签引物设计 | 第40页 |
| 3.3.2 定点突变打靶载体pNP-NPⅠ-6His、 pNP-NPⅠ-Y122FK246ID382V-6His、pNP-NPⅠ-Y122FK246ID382VY186S-6His的构建 | 第40-42页 |
| 3.3.3 表达载体pNP-NPⅠ-6His、pNP-NPⅠ-Y122FK246ID382V-6His和pNP-NPⅠ-Y122FK246ID382VY186S-6His的转化与鉴定 | 第42页 |
| 3.3.4 表达载体pNP-NPⅠ-6His、pNP-NPⅠ-Y122FK246ID382V-6His和pNP-NPⅠ-Y122FK246ID382VY186S-6His的线性化 | 第42-43页 |
| 3.3.5 米曲霉AS11菌丝体的培养 | 第43页 |
| 3.3.6 米曲霉AS11原生质体的制备 | 第43-44页 |
| 3.3.6.1 菌丝体的制备 | 第43-44页 |
| 3.3.7 PEG介导的原生质体转化 | 第44页 |
| 3.3.8 转化子的筛选 | 第44-45页 |
| 3.3.9 打靶载体插入菌株鉴定 | 第45页 |
| 3.3.9.1 基因组的提取 | 第45页 |
| 3.3.9.2 转化子PCR鉴定 | 第45页 |
| 3.3.10 化子和前期菌株的固态发酵产酶情况 | 第45-46页 |
| 3.3.10.1 中性蛋白酶活力分析 | 第45-46页 |
| 3.4 结果与分析 | 第46-52页 |
| 3.4.1 表达载体的构建结果 | 第46-47页 |
| 3.4.2 米曲霉原生质体的制备 | 第47-48页 |
| 3.4.3 原生质体转化及转化子的筛选 | 第48-51页 |
| 3.4.5 米曲霉的固态发酵 | 第51页 |
| 3.4.6 酶活测定 | 第51-52页 |
| 3.5 讨论 | 第52-53页 |
| 3.6 小结 | 第53-54页 |
| 第四章 结论和展望 | 第54-55页 |
| 4.1 主要研究结论 | 第54页 |
| 4.2 进一步的工作方向 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
