| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-17页 |
| 1.1 热纤梭菌的简介 | 第10页 |
| 1.2 热纤梭菌纤维小体的研究 | 第10-12页 |
| 1.2.1 纤维小体的简介 | 第10-11页 |
| 1.2.2 纤维小体的研究进展 | 第11-12页 |
| 1.2.3 纤维素结合域(CBD)的研究进展 | 第12页 |
| 1.3 内切葡聚糖酶 | 第12-13页 |
| 1.4 纤维二糖酶 | 第13页 |
| 1.5 立题背景及本文研究内容 | 第13-17页 |
| 1.5.1 立题背景 | 第13-14页 |
| 1.5.2 本文研究内容和技术路线 | 第14-17页 |
| 第二章 内切葡聚糖酶(CelD)分子改造及酶学性质的研究 | 第17-42页 |
| 2.1 材料 | 第17-21页 |
| 2.1.0 菌种与质粒 | 第17页 |
| 2.1.1 培养基 | 第17-19页 |
| 2.1.2 培养条件 | 第19页 |
| 2.1.3 主要化学试剂及酶 | 第19-20页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第20-21页 |
| 2.1.5 DNA引物合成和DNA测序服务 | 第21页 |
| 2.2 方法 | 第21-30页 |
| 2.2.1 C.thermocellum基因组的提取及检测 | 第21-22页 |
| 2.2.2 分子生物学基本操作 | 第22-24页 |
| 2.2.2.1 电转化感受态细胞的制备 | 第22页 |
| 2.2.2.2 PCR方法扩增目的片段 | 第22-23页 |
| 2.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳胶目的DNA片断回收 | 第23页 |
| 2.2.2.4 DNA磷酸化反应以及连接反应 | 第23页 |
| 2.2.2.5 E.coli DH10B和E.coli BL21感受态细胞的电转化操作 | 第23-24页 |
| 2.2.2.6 P1、P2、P3法(即碱变性法)抽提质粒 | 第24页 |
| 2.2.2.7 酶切反应 | 第24页 |
| 2.2.3 内切葡聚糖酶(CelD)的基因克隆,分子改造及表达 | 第24-26页 |
| 2.2.3.1 质粒pHsh-CelD Ⅰ的构建 | 第24页 |
| 2.2.3.2 内切葡聚糖酶基因C-端结构的优化 | 第24-25页 |
| 2.2.3.3 内切葡聚糖酶与C-端优化后的酶在降解底物上的初步研究 | 第25页 |
| 2.2.3.4 融合表达质粒的构建 | 第25页 |
| 2.2.3.5 CelD及融合酶在E.coli BL21中热激表达 | 第25-26页 |
| 2.2.3.6 CelD及NcelD的纯化方法 | 第26页 |
| 2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第26-27页 |
| 2.2.5 蛋白质浓度的测定 | 第27-28页 |
| 2.2.6 葡萄糖的标准曲线 | 第28-29页 |
| 2.2.7 内切葡聚糖酶酶活测定方法 | 第29页 |
| 2.2.8 内切葡聚糖酶的酶学性质分析 | 第29-30页 |
| 2.2.8.1 温度对内切葡聚糖酶活性的影响 | 第29-30页 |
| 2.2.8.2 pH对内切葡聚糖酶活性的影响 | 第30页 |
| 2.3 结果与分析 | 第30-39页 |
| 2.3.1 表达质粒pHsh-CelD的构建 | 第30-31页 |
| 2.3.2 重组表达质粒C-端分子结构的改造 | 第31-32页 |
| 2.3.3 内切葡聚糖酶与C-端优化后的酶在降解底物上的初步研究 | 第32页 |
| 2.3.4 重组表达质粒pHsh-CelD-CBD的构建 | 第32-33页 |
| 2.3.5 内切葡聚糖酶在E.coli BL21中的表达及纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.6 内切葡聚糖酶的酶学性质 | 第34-38页 |
| 2.3.6.1 内切葡聚糖酶的最适反应pH | 第34-35页 |
| 2.3.6.2 内切葡聚糖酶的pH稳定性 | 第35-36页 |
| 2.3.6.3 内切葡聚糖酶的最适反应温度 | 第36-37页 |
| 2.3.6.4 内切葡聚糖酶半衰期的测定 | 第37-38页 |
| 2.3.7 内切葡聚糖酶的CMC酶活和结晶纤维素酶活比较 | 第38-39页 |
| 2.4 讨论 | 第39-42页 |
| 第三章 纤维二糖酶基因的克隆及分子改造的研究 | 第42-51页 |
| 3.1 材料 | 第42页 |
| 3.1.1 菌种与质粒 | 第42页 |
| 3.1.2 培养基和培养基的配制 | 第42页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第42页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第42页 |
| 3.2 方法 | 第42-44页 |
| 3.2.1 电转化感受态细胞的制备 | 第42页 |
| 3.2.2 热纤梭菌基因组的提取及检测 | 第42页 |
| 3.2.3 基因操作 | 第42页 |
| 3.2.4 纤维二糖酶(CelS)的基因克隆,分子改造及表达 | 第42-43页 |
| 3.2.4.1 重组质粒pHsh-CelS Ⅰ的构建 | 第42-43页 |
| 3.2.4.2 纤维二糖酶基因celS的改造 | 第43页 |
| 3.2.5 分泌型表达质粒pHsh-ex-CelS的构建 | 第43-44页 |
| 3.2.6 重组质粒的转化与表达 | 第44页 |
| 3.2.7 纤维二糖酶(CelS)表达的SDS-PAGE | 第44页 |
| 3.2.8 纤维二糖酶(CelS)粗酶提取与酶活性测定 | 第44页 |
| 3.3 结果与分析 | 第44-49页 |
| 3.3.1 重组质粒pHsh-CelS Ⅰ的构建 | 第45页 |
| 3.3.2 纤维二糖酶基因的改造 | 第45-46页 |
| 3.3.3 重组质粒pHsh-ex-CelS的构建 | 第46-47页 |
| 3.3.4 纤维二糖酶的SDS-PAGE检测及酶活测定 | 第47-49页 |
| 3.4 讨论 | 第49-51页 |
| 第四章 全文总结 | 第51-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 致谢 | 第56页 |
