| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-24页 |
| 1 无性产孢和有性生殖的研究现状 | 第11-13页 |
| 1.1 无性产孢的研究现状 | 第11-12页 |
| 1.2 有性生殖的研究现状 | 第12-13页 |
| 2 钙离子信号途径 | 第13-19页 |
| 2.1 质膜上钙离子通道 | 第14-16页 |
| 2.1.1 高亲和性钙离子通道 | 第14-15页 |
| 2.1.2 低亲和性钙离子通道 | 第15-16页 |
| 2.2 钙泵 | 第16页 |
| 2.3 钙离子信号传感器 | 第16-18页 |
| 2.4 钙离子交换器及其它Ca~(2+)/CAM结合蛋白 | 第18-19页 |
| 3 钙信号通路参与丝状真菌的生长发育 | 第19-20页 |
| 4 模式生物构巢曲霉ASPERGILLUS NIDULANS | 第20-21页 |
| 5 本课题的研究内容、思路及方法 | 第21-24页 |
| 5.1 研究内容 | 第21页 |
| 5.2 研究思路 | 第21-22页 |
| 5.3 研究方法 | 第22-24页 |
| 5.3.1 构巢曲霉中FigA在构巢曲霉生长发育过程中的时空分布 | 第22-23页 |
| 5.3.2 构巢曲霉中FigA在极性生长、无性产孢和有性生殖过程中的功能研究 | 第23-24页 |
| 第二章 FigA的初步功能研究及相关菌株的构建 | 第24-48页 |
| 第一节 FigA的初步功能研究 | 第24-36页 |
| 1.1 FIGA蛋白的信息学分析 | 第24-25页 |
| 1.1.1 方法 | 第24页 |
| 1.1.1.1 比对酵母蛋白Fig1在构巢曲霉中的同源蛋白 | 第24页 |
| 1.1.1.2 在真菌中比对FigA蛋白的保守结构域 | 第24页 |
| 1.1.2 结果 | 第24-25页 |
| 1.1.2.1 酵母蛋白Fig1在构巢曲霉中的同源蛋白FigA | 第24-25页 |
| 1.1.2.2 真菌中FigA蛋白的保守结构域分析 | 第25页 |
| 1.2 FIGA定位在构巢曲霉的隔膜上 | 第25-30页 |
| 1.2.1 材料与方法 | 第25-28页 |
| 1.2.1.1 菌种及培养条件 | 第25页 |
| 1.2.1.2 试剂和仪器 | 第25-26页 |
| 1.2.1.3 荧光标记菌株Fig::GFP的构建 | 第26-27页 |
| 1.2.1.4 观察FigA在菌丝中的蛋白定位 | 第27-28页 |
| 1.2.1.5 激光共聚焦显微镜观察菌丝三维立体的荧光定位 | 第28页 |
| 1.2.2 实验结果 | 第28-30页 |
| 1.2.2.1 FigA-GFP菌株的分子鉴定 | 第28-29页 |
| 1.2.2.2 FigA-GFP菌株的荧光定位 | 第29-30页 |
| 1.3 在曲霉生长的不同时期FIGA的转录水平 | 第30-34页 |
| 1.3.1 材料与方法 | 第30-34页 |
| 1.3.1.1 菌株与培养条件 | 第30-31页 |
| 1.3.1.2 试剂与仪器 | 第31页 |
| 1.3.1.3 提取基因组RNA并进行定量PCR | 第31-34页 |
| 1.3.2 实验结果 | 第34页 |
| 1.4 讨论 | 第34-36页 |
| 第二节 菌株的构建和鉴定 | 第36-48页 |
| 2.1 材料与方法 | 第36-45页 |
| 2.1.1 菌种与培养条件 | 第36页 |
| 2.1.2 试剂与仪器 | 第36-38页 |
| 2.1.3 A.nidulans基因组DNA的提取 | 第38页 |
| 2.1.4 利用营养筛选标记构建figA的敲除菌 | 第38-44页 |
| 2.1.4.1 引物设计 | 第39-40页 |
| 2.1.4.2 融合PCR | 第40-41页 |
| 2.1.4.3 三片段连接Fusion PCR,产物纯化和质量评估 | 第41-42页 |
| 2.1.4.4 PCR的产物连接到载体上并进行转化 | 第42页 |
| 2.1.4.5 构巢曲霉的转化方法(如下所示) | 第42-43页 |
| 2.1.4.6 重组子的初步筛选 | 第43页 |
| 2.1.4.7 诊断PCR | 第43-44页 |
| 2.1.4.8 在△figA菌中测试figA的表达量 | 第44页 |
| 2.1.5 构建△figA△midA和△figA△cchA双敲菌株 | 第44-45页 |
| 2.2 结果 | 第45-47页 |
| 2.2.1 figA基因缺失菌的分子鉴定 | 第45-47页 |
| 2.2.1.1 △figA重组子的初步表型鉴定 | 第45页 |
| 2.2.1.2 figA敲除菌PCR诊断结果 | 第45-47页 |
| 2.2.2 △figA△midA和△figA△cchA双敲菌株的分子鉴定 | 第47页 |
| 2.3 讨论 | 第47-48页 |
| 第三章 figA基因的缺失会影响构巢曲霉的正常菌丝生长和无性产孢 | 第48-56页 |
| 1 材料与方法 | 第48-50页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第48页 |
| 1.2 试剂与仪器 | 第48页 |
| 1.3 figA缺失对菌丝生长和产孢的影响 | 第48页 |
| 1.4 胞外钙离子对figA缺失菌的影响 | 第48-49页 |
| 1.5 △figA产孢结构的显微观察 | 第49页 |
| 1.6 缺失菌中细胞核和隔的观察 | 第49-50页 |
| 1.7 提高figA的表达量对△figA的缺陷菌的影响 | 第50页 |
| 1.7.1 构建条件菌株Cf1和Of1 | 第50页 |
| 1.7.2 通过对启动子的调控而调节△figA中figA的表达量 | 第50页 |
| 2 试验结果 | 第50-55页 |
| 2.1 figA基因的缺失使菌落直径变小和产孢量减少 | 第50-51页 |
| 2.2 外钙可以恢复△figA菌丝生长 | 第51-52页 |
| 2.3 figA基因的缺失会导致曲霉的产孢结构异常 | 第52-53页 |
| 2.4 figA基因的缺失没有影响菌丝的核隔分布 | 第53-54页 |
| 2.5 提高figA的表达量可以有效减弱△figA的缺陷表型 | 第54-55页 |
| 3 讨论 | 第55-56页 |
| 第四章 figA以及riboB2的缺失会影响构巢曲霉的有性生殖 | 第56-69页 |
| 第一节 figA的缺失对构巢曲霉的有性生殖的影响 | 第56-60页 |
| 1.1 材料与方法 | 第56-57页 |
| 1.1.1 菌种与培养条件 | 第56页 |
| 1.1.2 试剂与仪器 | 第56页 |
| 1.1.3 构巢曲霉的有性生殖(自交) | 第56页 |
| 1.1.4 外钙对△figA的有性生殖的影响(自交) | 第56-57页 |
| 1.2 实验结果 | 第57-58页 |
| 1.2.1 △figA不能自交 | 第57页 |
| 1.2.2 外钙的加入并不能恢复△figA的自交缺陷 | 第57-58页 |
| 1.3 讨论 | 第58-60页 |
| 第二节 riboB2基因的缺失对构巢曲霉的有性生殖的影响 | 第60-69页 |
| 2.1 材料与方法 | 第60-62页 |
| 2.1.1 菌株与培养条件 | 第60-61页 |
| 2.1.2 试剂与仪器 | 第61页 |
| 2.1.3 构巢曲霉在菌丝生长和无性产孢时所需riboflavin的最低浓度 | 第61-62页 |
| 2.1.4 探究riboB2的缺陷菌自交所需的核黄素浓度 | 第62页 |
| 2.1.5 检测提高核黄素的浓度是否可以使两株riboB2的缺陷菌进行杂交 | 第62页 |
| 2.2 实验结果 | 第62-66页 |
| 2.2.1 构巢曲霉的菌丝生长和无性产孢所需的riboflavin是不同的 | 第62-64页 |
| 2.2.2 外加的riboflavin可以恢复riboB2缺陷菌的自交缺陷 | 第64-65页 |
| 2.2.3 riboflavin可以使两株riboB2缺陷菌进行杂交 | 第65-66页 |
| 2.3 讨论 | 第66-69页 |
| 2.3.1 riboflavin的浓度会影响构巢曲霉的生长发育 | 第66-67页 |
| 2.3.2 外加过量riboflavin不能恢复△figA的有性生殖缺陷 | 第67-69页 |
| 第五章 brlA和nsdD在△figA中的表达量明显降低 | 第69-73页 |
| 1 材料与方法 | 第69-70页 |
| 1.1 菌种与培养条件 | 第69页 |
| 1.2 试剂与仪器 | 第69页 |
| 1.3 在△figA中检测brlA、nsdD和steA的表达量 | 第69-70页 |
| 2 实验结果 | 第70-72页 |
| 2.1 figA基因的缺失会使brlA的转录极大的降低 | 第70-71页 |
| 2.2 figA基因的缺失会使nsdD的转录极大的降低 | 第71页 |
| 2.3 steA在△figA中的转录水平并未降低 | 第71-72页 |
| 3 讨论 | 第72-73页 |
| 第六章 结论 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 附录一 | 第80-81页 |
| 附录二 | 第81-82页 |
| 在读期间发表的学术论文与研究成果 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
