| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第11-26页 |
| 1.1 天然橡胶的生产现状 | 第11页 |
| 1.2 天然橡胶生物合成 | 第11-13页 |
| 1.3 天然橡胶生物合成相关基因 | 第13-14页 |
| 1.4 WRKY转录因子家族研究进展 | 第14-15页 |
| 1.5 酵母双杂交的研究进展及系统介绍 | 第15-17页 |
| 1.6 酵母单杂交技术的原理及研究进展 | 第17-21页 |
| 1.7. 高等植物启动子的基本特点 | 第21-24页 |
| 1.7.1 特殊的上游顺式作用元件及启动子结构中几种特殊BOX结构 | 第22-23页 |
| 1.7.2 高等植物启动子的类型 | 第23-24页 |
| 1.8 本研究的目的和意义 | 第24-25页 |
| 1.9 本研究技术路线 | 第25-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-55页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第26页 |
| 2.1.2 质粒及菌种 | 第26页 |
| 2.1.3 试剂 | 第26-27页 |
| 2.2 巴西橡胶树HbWRKY1启动子的克隆 | 第27-31页 |
| 2.2.1 橡胶树基因组DNA的提取 | 第27页 |
| 2.2.2 引物的设计及合成 | 第27页 |
| 2.2.3 染色体步移文库的构建及Genome Walker DNA Walking | 第27-28页 |
| 2.2.4 PCR产物的回收 | 第28页 |
| 2.2.5 连接反应 | 第28页 |
| 2.2.6 E.coli DH5α化转感受态的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.7 感受态的鉴定 | 第29页 |
| 2.2.8 转化 | 第29-30页 |
| 2.2.9 质粒DNA的提取 | 第30页 |
| 2.2.10 重组子的酶切鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.11 重组子菌种的保存 | 第31页 |
| 2.3 HbWRKYl基因启动子的5’缺失体植物表达载体的构建 | 第31-33页 |
| 2.3.1 引物设计与合成 | 第31页 |
| 2.3.2 HbWRKY1基因启动子的5’缺失体重组质粒的构建及鉴定 | 第31-32页 |
| 2.3.3 HbWRKY1基因启动子(pHbWRKY1～4)的酶切 | 第32页 |
| 2.3.4 植物表达载体pCAMBIA1381Z的酶切 | 第32-33页 |
| 2.3.5 目的片段与表达载体的连接 | 第33页 |
| 2.4 植物表达载体pCAMBIA1381Z-P1～P4转化农杆菌菌株GV3301 | 第33-34页 |
| 2.4.1 电击法农杆菌菌株GV3301电转感受态制备 | 第33页 |
| 2.4.2 植物表达载体pCAMBIA1381Z-P1～P4电击转化农杆菌GV3301感受态 | 第33-34页 |
| 2.4.3 菌株鉴定 | 第34页 |
| 2.5 植物表达载体pCAMBIA1381Z-P1～P4农杆菌侵染本生烟叶盘获得转基因T_1代植株 | 第34-37页 |
| 2.5.1 野生型本生烟草无菌苗的准备 | 第34页 |
| 2.5.2 叶盘法转化烟草 | 第34-35页 |
| 2.5.3 烟草转化植株的PCR检测 | 第35-36页 |
| 2.5.4. HbWRKY1基因启动子5’缺失体转基因烟草T_1代无菌苗的获得 | 第36-37页 |
| 2.5.5 HbWRKY1基因启动子5’缺失体转基因烟草T_1代的GUS检测 | 第37页 |
| 2.6 HbWRKY1基因启动子的诱饵载体(pHis2.1-pHbWRKY1)的构建与鉴定 | 第37-39页 |
| 2.6.1 引物设计与合成 | 第37页 |
| 2.6.2 重组质粒pMD19-T-pHbWRKY1的构建及鉴定 | 第37页 |
| 2.6.3 HbWRKY1基因启动子(pHbWRKY1)的酶切 | 第37-38页 |
| 2.6.4 酵母单杂交诱饵载体质粒pHis2.1的酶切 | 第38页 |
| 2.6.5 目的片段与表达载体的连接 | 第38页 |
| 2.6.6 转化 | 第38页 |
| 2.6.7 质粒DNA的提取 | 第38-39页 |
| 2.6.8 重组子的筛选鉴定 | 第39页 |
| 2.6.9 重组子菌种的保存 | 第39页 |
| 2.7 酵母单杂交菌株Y187表型的鉴定 | 第39页 |
| 2.8 酵母感受态细胞的制备 | 第39-40页 |
| 2.9 酵母单杂交阴阳性对照实验 | 第40-41页 |
| 2.10 酵母单杂交诱饵载体pHis2.1-pHbWRKY1的3-AT背景浓度的筛选 | 第41页 |
| 2.11 天然橡胶胶乳cDNA文库的构建 | 第41-44页 |
| 2.11.1 巴西橡胶树胶乳总RNA的提取 | 第41-42页 |
| 2.11.2 胶乳总RNA中mRNA的分离纯化 | 第42-43页 |
| 2.11.3 利用纯化mRNA进行cDNA的合成 | 第43-44页 |
| 2.11.4 双链cDNA纯化 | 第44页 |
| 2.12 诱饵载体与cDNA文库质粒的大规模杂交筛选 | 第44-46页 |
| 2.12.1 文库载体pGADT7-Rec2的线性化 | 第45页 |
| 2.12.2 酵母感受态细胞的制备 | 第45页 |
| 2.12.3 诱饵载体与cDNA文库共转化酵母 | 第45-46页 |
| 2.13 阳性克隆的分离验证 | 第46-47页 |
| 2.13.1 酵母菌落PCR初步筛选阳性克隆 | 第46页 |
| 2.13.2 酵母质粒的提取 | 第46页 |
| 2.13.3 酵母质粒转化大肠杆菌 | 第46-47页 |
| 2.13.4 文库质粒的分离及测序分析 | 第47页 |
| 2.14 酵母双杂交酵母菌株表型的鉴定 | 第47页 |
| 2.15 酵母感受态细胞的制备 | 第47-48页 |
| 2.16 酵母双杂交阴阳性对照实验 | 第48-49页 |
| 2.17 诱饵载体的自激活检验毒性检验 | 第49页 |
| 2.18 诱饵载体的毒性检验 | 第49-50页 |
| 2.19 酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-HbWRKY1的3-AT抑制浓度的筛选 | 第50页 |
| 2.20 酵母双杂交的胶乳cDNA文库的构建 | 第50-51页 |
| 2.20.1 双链cDNA的纯化及文库质粒处理 | 第50页 |
| 2.20.2 线性化的pGADT7-Rec2和cDNA文库质粒大规模地向酵母共转化 | 第50-51页 |
| 2.21 诱饵载体与表达文库的杂交 | 第51-53页 |
| 2.21.1 文库滴度检验 | 第52页 |
| 2.21.2 文库杂交镜检 | 第52页 |
| 2.21.3 杂交率的计算 | 第52页 |
| 2.21.4 营养缺陷培养基筛选阳性克隆及验证 | 第52-53页 |
| 2.21.5 酵母菌落PCR初步确定阳性克隆 | 第53页 |
| 2.22 文库质粒的分离与鉴定 | 第53-55页 |
| 2.22.1 酵母质粒的提取 | 第53页 |
| 2.22.2 酵母质粒电击转化大肠杆菌 | 第53-54页 |
| 2.22.3 文库质粒的分离及分析 | 第54-55页 |
| 3 结果与分析 | 第55-74页 |
| 3.1 HbWRKY1基因5’调控序列的分离及序列分析 | 第55-58页 |
| 3.1.1 Genome walker文库的构建 | 第55-56页 |
| 3.1.2 HbWRKY1基因5’调控序列的克隆 | 第56页 |
| 3.1.3 HbWRKY1基因5’调控序列的序列分析 | 第56-58页 |
| 3.2 HbWRKY1基因5’调控序列及缺失片段的功能验证 | 第58-60页 |
| 3.2.1 HbWRKY1基因5’调控序列及缺失片段转基因烟草获得 | 第59页 |
| 3.2.2 HbWRKY1基因5’调控序列及缺失片段转基因烟草T_1代GUS活性处理 | 第59-60页 |
| 3.3 调控HbWRKY1的转录因子的初步筛选 | 第60-69页 |
| 3.3.1 诱饵载体的构建 | 第60-61页 |
| 3.3.2 3-AT浓度的筛选 | 第61页 |
| 3.3.3 酵母单杂交cDNA文库的构建与杂交筛库 | 第61-63页 |
| 3.3.4 诱饵载体和线性化cDNA文库质粒共转化酵母 | 第63-64页 |
| 3.3.5 阳性克隆的初步筛选 | 第64-65页 |
| 3.3.6 分离cDNA文库质粒 | 第65-69页 |
| 3.4 与HbWRKY1相互作用蛋白的筛选 | 第69-74页 |
| 3.4.1 诱饵载体的构建与自激活检测 | 第69-70页 |
| 3.4.2 3-AT抑制浓度的筛选 | 第70-71页 |
| 3.4.3 杂交率的计算 | 第71-72页 |
| 3.4.4 阳性克隆的筛选 | 第72-74页 |
| 4 讨论 | 第74-77页 |
| 4.1 HbWRKY1基因5’调控序列功能分析 | 第74-75页 |
| 4.2 调HbWRKY1基因转录因子的筛选 | 第75-76页 |
| 4.3 与HbWRKY1蛋白相互作用蛋白的筛选 | 第76-77页 |
| 5 结论 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-86页 |
| 附录 | 第86-92页 |
| 致谢 | 第92页 |
