| 摘要 | 第3-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 第1章 绪论 | 第16-32页 |
| 1.1 计算机辅助蛋白质设计研究概况 | 第17-22页 |
| 1.1.1 计算机辅助蛋白质设计的定义 | 第17页 |
| 1.1.2 计算机辅助蛋白质分子设计前的准备 | 第17-20页 |
| 1.1.2.1 蛋白质分子设计的两个不同层次 | 第17页 |
| 1.1.2.2 蛋白质分子设计流程 | 第17-19页 |
| 1.1.2.3 蛋白质设计的目标及解决的方法 | 第19页 |
| 1.1.2.4 突变体设计的步骤 | 第19-20页 |
| 1.1.3 蛋白质设计的途径和方法 | 第20-21页 |
| 1.1.3.1 理性设计 | 第20页 |
| 1.1.3.2 非理性设计 | 第20-21页 |
| 1.1.4 基于计算机辅助蛋白质设计的参数 | 第21-22页 |
| 1.2 植酸酶研究概况 | 第22-27页 |
| 1.2.1 植酸酶和植酸 | 第22-23页 |
| 1.2.2 植酸酶的来源 | 第23页 |
| 1.2.2.1 动物来源的植酸酶 | 第23页 |
| 1.2.2.2 植物来源的植酸酶 | 第23页 |
| 1.2.2.3 微生物来源的植酸酶 | 第23页 |
| 1.2.3 植酸酶的分类 | 第23-24页 |
| 1.2.4 植酸酶基因工程表达系统 | 第24页 |
| 1.2.5 植酸酶的应用及发展 | 第24-27页 |
| 1.2.5.1 植酸酶作为添加剂的应用 | 第24-25页 |
| 1.2.5.2 植酸酶在食品产业中的应用 | 第25-26页 |
| 1.2.5.3 植酸酶在生物技术中的应用 | 第26页 |
| 1.2.5.4 植酸酶的发展前景 | 第26-27页 |
| 1.3 木聚糖酶研究的基本概况 | 第27-30页 |
| 1.3.1 木聚糖酶家族及特点 | 第27页 |
| 1.3.2 木聚糖酶酶学性质 | 第27-28页 |
| 1.3.3 木聚糖酶的分子催化机理及结构 | 第28页 |
| 1.3.4 木聚糖酶的应用 | 第28-29页 |
| 1.3.4.1 木聚糖酶在造纸产业中的应用 | 第28页 |
| 1.3.4.2 木聚糖酶在食品产业中的应用 | 第28-29页 |
| 1.3.4.3 木聚糖酶在饲料产业中的应用 | 第29页 |
| 1.3.4.4 木聚糖酶在其他方面的应用 | 第29页 |
| 1.3.5 木聚糖酶基因的克隆与表达 | 第29页 |
| 1.3.6 木聚糖酶的国内外研究概况、水平和发展趋势 | 第29-30页 |
| 1.4 研究目的和意义 | 第30页 |
| 1.5 研究内容 | 第30-32页 |
| 第2章 根据RMSD值对植酸酶酶学特性的改造 | 第32-59页 |
| 2.1 晶体结构计算分析确定突变位点 | 第32页 |
| 2.2 实验材料 | 第32-35页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第32-33页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第33页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第33页 |
| 2.2.4 常用溶液 | 第33-34页 |
| 2.2.5 常用培养基 | 第34页 |
| 2.2.6 DNA测序与引物合成 | 第34-35页 |
| 2.3 实验方法 | 第35-45页 |
| 2.3.1 大肠杆菌pMD19-T-phy-N突变模板的构建 | 第35-38页 |
| 2.3.1.1 植酸酶phy-N目的基因的扩增 | 第35-36页 |
| 2.3.1.2 PCR扩增产物的纯化 | 第36页 |
| 2.3.1.3 大肠杆菌E.coli Trans1-T1感受态细胞制备 | 第36页 |
| 2.3.1.4 连接 | 第36-37页 |
| 2.3.1.5 转化 | 第37页 |
| 2.3.1.6 阳性重组子的鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.2 植酸酶p MD19-T-phy-N-18 的获得 | 第38-40页 |
| 2.3.2.1 突变引物的设计 | 第38-39页 |
| 2.3.2.2 突变的实施 | 第39-40页 |
| 2.3.2.3 突变后的检测 | 第40页 |
| 2.3.3 植酸酶phy-N-18 真核表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.3.3.1 植酸酶phy-N-18 目的基因和线性化载体的获取 | 第40页 |
| 2.3.3.2 PCR扩增产物及线性化载体的纯化 | 第40页 |
| 2.3.3.3 连接 | 第40-41页 |
| 2.3.3.4 转化 | 第41页 |
| 2.3.3.5 阳性重组子的鉴定 | 第41页 |
| 2.3.4 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N在毕赤酵母中的高效表达 | 第41-42页 |
| 2.3.4.1 重组质粒的线性化 | 第41页 |
| 2.3.4.2 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第41-42页 |
| 2.3.4.3 电转化及阳性克隆菌株的获得 | 第42页 |
| 2.3.4.4 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N的诱导表达 | 第42页 |
| 2.3.5 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N的检测及定量 | 第42-43页 |
| 2.3.6 植酸酶酶活力的测定 | 第43-44页 |
| 2.3.6.1 方法原理 | 第43页 |
| 2.3.6.2 标准曲线 | 第43-44页 |
| 2.3.6.3 反应 | 第44页 |
| 2.3.6.4 样品测定 | 第44页 |
| 2.3.6.5 植酸酶活性单位定义 | 第44页 |
| 2.3.7 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N的酶学性质 | 第44-45页 |
| 2.3.7.1 pH适性和温度适性的测定 | 第44-45页 |
| 2.3.7.2 不同化学试剂及金属离子对植酸酶酶活力的影响的测定 | 第45页 |
| 2.3.7.3 动力学常数Km和Vmax的测定 | 第45页 |
| 2.3.7.4 重组植酸酶与市场产品耐热性对比的测定 | 第45页 |
| 2.4 结果与分析 | 第45-57页 |
| 2.4.1 植酸酶phy-N和phy-F晶体结构比对 | 第45-46页 |
| 2.4.2 植酸酶p MD19-T-phy-N突变模板的构建 | 第46-47页 |
| 2.4.2.1 phy-N的基因扩增及突变模板质粒pMD19-T-phy-N的构建 | 第46-47页 |
| 2.4.2.2 重组质粒pMD19-T-phy-N的转化 | 第47页 |
| 2.4.3 植酸酶p MD19-T-phy-N-18 的构建 | 第47-48页 |
| 2.4.3.1 重组质粒pMD19-T-phy-N-18 植酸酶的定点突变 | 第47-48页 |
| 2.4.3.2 重组质粒pMD19-T-phy-N-18 植酸酶的转化 | 第48页 |
| 2.4.4 重组质粒pPIC9K-phy-N-18 的构建 | 第48-50页 |
| 2.4.4.1 突变型phy-N-18 基因全长的扩增及表达载体pPIC9K的线性化 | 第48-49页 |
| 2.4.4.2 植酸酶phy-N-18 与载体pPIC9K的连接及转化 | 第49-50页 |
| 2.4.5 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N在毕赤酵母中的高效表达 | 第50-51页 |
| 2.4.6 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N的鉴定 | 第51-52页 |
| 2.4.7 植酸酶phy-N-18 及phy-N酶学性质比较研究 | 第52-57页 |
| 2.4.7.1 植酸酶活性分析 | 第52页 |
| 2.4.7.2 植酸酶的pH活性和pH稳定性测定 | 第52-53页 |
| 2.4.7.3 植酸酶phy-N和phy-N-18 的最适温度和热稳定性测定 | 第53-55页 |
| 2.4.7.4 金属离子对植酸酶phy-N和phy-N-18 活力的影响 | 第55-56页 |
| 2.4.7.5 植酸酶phy-N和phy-N-18 的动力学参数 | 第56页 |
| 2.4.7.6 植酸酶phy-N和phy-N-18 与市场产品耐热性的比较 | 第56-57页 |
| 2.5 讨论 | 第57-58页 |
| 2.6 本章小结 | 第58-59页 |
| 第3章 分子动力学模拟改造植酸酶酶学特性 | 第59-76页 |
| 3.1 分子动力学模拟确定phy-N-18 耐热机制 | 第59页 |
| 3.2 实验材料 | 第59页 |
| 3.3 实验方法 | 第59-60页 |
| 3.3.1 分子动力学模拟细节 | 第59-60页 |
| 3.3.2 植酸酶phy-N-9 突变的实施及突变体的克隆、表达、酶学特性的研究 | 第60页 |
| 3.4 结果与分析 | 第60-73页 |
| 3.4.1 突变位点形成的氢键致使phy-N-18 的热稳定性提高 | 第60-64页 |
| 3.4.2 植酸酶p MD19-T-phy-N-9 的构建 | 第64-65页 |
| 3.4.2.1 重组质粒pMD19-T-phy-N-9 植酸酶的定点突变 | 第64-65页 |
| 3.4.2.2 重组质粒pMD19-T-phy-N-9 植酸酶的转化 | 第65页 |
| 3.4.3 重组质粒pPIC9K-phy-N-9 的构建 | 第65-67页 |
| 3.4.3.1 突变型phy-N-9 基因全长的扩增及表达载体pPIC9K的线性化 | 第65-66页 |
| 3.4.3.2 植酸酶phy-N-9 与载体pPIC9K的连接及转化 | 第66-67页 |
| 3.4.4 重组植酸酶phy-N-9 在毕赤酵母中的高效表达 | 第67页 |
| 3.4.5 重组植酸酶phy-N-9 的鉴定 | 第67-68页 |
| 3.4.6 突变型植酸酶phy-N-9、phy-N-18 及phy-N酶学性质比较性研究 | 第68-73页 |
| 3.4.6.1 植酸酶活性分析 | 第68页 |
| 3.4.6.2 植酸酶的pH活性和pH稳定性测定 | 第68-69页 |
| 3.4.6.3 植酸酶phy-N、phy-N-18 与phy-N-9 的最适温度和热稳定性测定 | 第69-71页 |
| 3.4.6.4 金属离子对植酸酶phy-N、phy-N-18 和phy-N-9 活力的影响 | 第71-72页 |
| 3.4.6.5 植酸酶phy-N、phy-N-18 和phy-N-9 的动力学参数 | 第72页 |
| 3.4.6.6 植酸酶phy-N、phy-N-18 和phy-N-9 与市场产品耐热性的比较 | 第72-73页 |
| 3.5 讨论 | 第73-74页 |
| 3.6 本章小结 | 第74-76页 |
| 第4章 利用温度因子(B-factor)对木聚糖酶酶学特性的改造 | 第76-101页 |
| 4.1 比较不同木聚糖酶温度因子确定突变位点 | 第76-77页 |
| 4.2 实验材料 | 第77页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第77页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第77页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第77页 |
| 4.2.4 主要培养基 | 第77页 |
| 4.2.5 主要溶液 | 第77页 |
| 4.2.6 DNA测序与引物合成 | 第77页 |
| 4.3 实验方法 | 第77-83页 |
| 4.3.1 木聚糖酶B-factor的计算 | 第77-78页 |
| 4.3.2 木聚糖酶的分子动力学模拟细节 | 第78页 |
| 4.3.3 大肠杆菌pMD19-T-XynCDBFV突变模板的构建 | 第78-79页 |
| 4.3.3.1 木聚糖酶目的基因的扩增 | 第78-79页 |
| 4.3.3.2 纯化PCR扩增产物 | 第79页 |
| 4.3.3.3 大肠杆菌E.coli Trans1-T1感受态细胞制备 | 第79页 |
| 4.3.3.4 连接 | 第79页 |
| 4.3.3.5 转化 | 第79页 |
| 4.3.3.6 阳性重组子的鉴定 | 第79页 |
| 4.3.4 木聚糖酶突变体pMD19-T-Xyn-MUT的构建 | 第79-80页 |
| 4.3.4.1 突变引物的设计 | 第79-80页 |
| 4.3.4.2 突变的实施 | 第80页 |
| 4.3.4.3 突变后的检测 | 第80页 |
| 4.3.5 木聚糖酶pGAP5`AOX-XynCDBFV及其突变体Xyn-MUT真核表达载体的构建 | 第80-81页 |
| 4.3.5.1 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT目的基因和线性化载体的获取 | 第80-81页 |
| 4.3.5.2 PCR扩增产物及线性化载体的纯化 | 第81页 |
| 4.3.5.3 连接 | 第81页 |
| 4.3.5.4 转化 | 第81页 |
| 4.3.5.5 阳性重组子的鉴定 | 第81页 |
| 4.3.6 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT在毕赤酵母中的高效表达 | 第81页 |
| 4.3.7 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT的纯化及鉴定 | 第81-82页 |
| 4.3.8 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT酶活测定方法 | 第82页 |
| 4.3.9 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT酶学特性分析 | 第82-83页 |
| 4.3.9.1 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT最适反应pH及p H稳定性 | 第82-83页 |
| 4.3.9.2 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT最适反应温度及温度稳定性 | 第83页 |
| 4.3.9.3 不同金属离子及化学试剂对木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT的影响 | 第83页 |
| 4.3.9.4 重组木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT酶促动力学参数 | 第83页 |
| 4.4 结果与分析 | 第83-98页 |
| 4.4.1 计算机辅助设计突变位点 | 第83-86页 |
| 4.4.2 突变位点所形成的氢键协助重组酶提高其耐热性 | 第86-88页 |
| 4.4.3 木聚糖酶pMD19-T-XynCDBFV突变模板的构建 | 第88-89页 |
| 4.4.3.1 XynCDBFV的基因扩增及突变模板质粒p MD19-T-XynCDBFV的构建 | 第88-89页 |
| 4.4.3.2 重组质粒pMD19-T-Xyn CDBFV的转化 | 第89页 |
| 4.4.4 木聚糖酶pMD19-T-Xyn-MUT的构建 | 第89-90页 |
| 4.4.4.1 重组质粒木聚糖酶p MD19-T-Xyn-MUT的定点突变 | 第89-90页 |
| 4.4.4.2 突变型重组质粒木聚糖酶pMD19-T-Xyn-MUT的转化 | 第90页 |
| 4.4.5 木聚糖酶重组质粒pGAP5`AOX-Xyn CDBFV及pGAP5`AOX-Xyn-MUT的构建 | 第90-92页 |
| 4.4.5.1 突变型Xyn-MUT基因及野生型XynCDBFV全长的扩增及表达载体p GAP5`AOX的线性化 | 第90-91页 |
| 4.4.5.2 突变型木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT与载体pGAP5`AOX连接及转化 | 第91-92页 |
| 4.4.6 重组木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT在毕赤酵母中的高效表达 | 第92-93页 |
| 4.4.7 重组木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT的纯化和鉴定 | 第93-94页 |
| 4.4.8 重组木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT的酶学性质研究 | 第94-98页 |
| 4.5 讨论 | 第98-99页 |
| 4.6 本章小节 | 第99-101页 |
| 第5章 总结与展望 | 第101-106页 |
| 5.1 总结 | 第101-104页 |
| 5.2 创新 | 第104页 |
| 5.3 展望 | 第104-106页 |
| 参考文献 | 第106-115页 |
| 附录 | 第115-125页 |
| 附录A 实验中所使用的缓冲液的配制 | 第115-117页 |
| A1 不同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制 | 第115页 |
| A2 不同pH值的甘氨酸-NaOH缓冲液的配制 | 第115-116页 |
| A3 不同pH值的Tris-HCl缓冲液的配制 | 第116页 |
| A4 不同pH值的乙酸-乙酸钠缓冲液的配制 | 第116-117页 |
| 附录B 本文所涉及到的氨基酸序列 | 第117-119页 |
| B1 黑曲霉植酸酶phy-N的氨基酸序列 | 第117页 |
| B2 烟曲霉植酸酶phy-F的氨基酸序列 | 第117页 |
| B3 突变体植酸酶phy-N-18 的氨基酸序列 | 第117-118页 |
| B4 突变体植酸酶phy-N-9 的氨基酸序列 | 第118页 |
| B5 木聚糖酶XynCDBFV的氨基酸序列 | 第118页 |
| B6 突变体木聚糖酶Xyn-MUT的氨基酸序列 | 第118-119页 |
| 附录C 本文所涉及到的核苷酸序列 | 第119-124页 |
| C1 黑曲霉植酸酶phy-N的核苷酸序列 | 第119页 |
| C2 烟曲霉植酸酶phy-F的核苷酸序列 | 第119-120页 |
| C3 突变型植酸酶phy-N-18 的核苷酸序列 | 第120-121页 |
| C4 突变型植酸酶phy-N-9 的核苷酸序列 | 第121-122页 |
| C5 木聚糖酶XynCDBFV的核苷酸序列 | 第122页 |
| C6 突变体木聚糖酶Xyn-MUT的核苷酸序列 | 第122-124页 |
| 附录D 氨基酸中英文对照及缩写表 | 第124-125页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 | 第125-126页 |
| 致谢 | 第126页 |
