| 摘要 | 第3-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 第一章 绪论 | 第17-41页 |
| 1.1 螺原体的发现、分类、生物学特性和致病机理的研究 | 第17-23页 |
| 1.1.1 螺原体的发现与相关报道 | 第17-19页 |
| 1.1.2 螺原体的基本生物学特性 | 第19-21页 |
| 1.1.3 螺原体的分布及其致病性 | 第21-22页 |
| 1.1.4 螺原体致病机制的研究进展 | 第22-23页 |
| 1.2 中华绒螯蟹螺原体的研究进展 | 第23-26页 |
| 1.2.1 中华绒螯蟹颤抖病的流行病学调查 | 第23页 |
| 1.2.2 中华绒螯蟹螺原体的研究进展 | 第23-26页 |
| 1.3 柔膜体纲细菌基因组学研究进展 | 第26-32页 |
| 1.3.1 螺原体比较基因组学研究 | 第28-29页 |
| 1.3.2 螺原体的基本代谢特征 | 第29-32页 |
| 1.4 磷脂酶的研究进展 | 第32-35页 |
| 1.4.1 磷脂酶的分类 | 第32页 |
| 1.4.2 磷脂酶的致病作用机理 | 第32页 |
| 1.4.3 溶血磷脂酶 | 第32-35页 |
| 1.5 精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,ADI)系统和精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,AgDI)系统的研究进展 | 第35-39页 |
| 1.5.1 精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,ADI)系统的生理功能 | 第35-37页 |
| 1.5.2 精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,ADI)系统的致病作用 | 第37-38页 |
| 1.5.4 鲱精胺脱亚胺酶(Agmatine deiminase,AgDI)系统 | 第38-39页 |
| 1.6 本论文的研究目的、内容、意义和技术路线 | 第39-41页 |
| 第二章 中华绒螯蟹螺原体溶血磷脂酶SE-LsyoPL基因的生物信息学分析及其克隆、表达纯化以及酶活性质的分析 | 第41-62页 |
| 2.1 材料 | 第41-45页 |
| 2.1.1 主要设备 | 第41-42页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第42-44页 |
| 2.1.3 引物设计与合成 | 第44-45页 |
| 2.2 方法 | 第45-69页 |
| 2.2.1 序列分析 | 第45-115页 |
| 2.2.2 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取 | 第115-45页 |
| 2.2.3 SE-LsyoPL基因PCR扩增 | 第45-46页 |
| 2.2.4 SE-LsyoPL基因与pUC载体的连接 | 第46页 |
| 2.2.5 pUC-SE-LsyoPL连接产物的转化 | 第46页 |
| 2.2.6 菌液PCR鉴定阳性克隆、测序分析 | 第46页 |
| 2.2.7 点突变实验 | 第46-48页 |
| 2.2.8 构建表达载体 | 第48页 |
| 2.2.9 表达重组蛋白及鉴定 | 第48-95页 |
| 2.2.10 Western blot分析蛋白表达结果确定目的蛋白诱导表达成功 | 第95-49页 |
| 2.2.11 Ni-NTA Agarose亲和层析 | 第49-50页 |
| 2.2.12 中华绒螯蟹溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)的活力测定和蛋白含量测定 | 第50页 |
| 2.2.13 酶学性质的测定 | 第50-51页 |
| 2.2.14 重组酶的底物特异性 | 第51-69页 |
| 2.3 结果 | 第69-59页 |
| 2.3.1 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取、SE-LsyoPL基因PCR扩增及序列分析 | 第115-55页 |
| 2.3.2 中华绒螯蟹螺原体SE-LsyoPL基因的点突变 | 第55页 |
| 2.3.3 原核表达载体的构建 | 第55-56页 |
| 2.3.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定 | 第56页 |
| 2.3.5 重组中华绒螯蟹磷脂酶(SE-LsyoPL)的酶学性质 | 第56-58页 |
| 2.3.6 重组中华绒螯蟹磷脂酶(SE-LsyoPL)的底物特异性 | 第58-59页 |
| 2.4 讨论 | 第59-62页 |
| 第三章 中华绒螯蟹螺原体溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)功能分析 | 第62-79页 |
| 3.1 主要实验材料、仪器与试剂 | 第62-64页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第62-63页 |
| 3.1.2 主要仪器和耗材 | 第63页 |
| 3.1.3 主要试剂配方 | 第63-64页 |
| 3.2 实验方法 | 第64-69页 |
| 3.2.1 制备多克隆抗体与其效价检测 | 第64-65页 |
| 3.2.2 Western blotting分析 | 第65页 |
| 3.2.3 中华绒螯蟹螺原体总蛋白和膜蛋白的提取 | 第65-66页 |
| 3.2.4 3T6细胞细胞培养与侵染 | 第66-67页 |
| 3.2.5 SE-LsyoPL抗体中和实验 | 第67页 |
| 3.2.6 间接免疫荧光法标记定位 | 第67-68页 |
| 3.2.7 土霉素法检测侵染率 | 第68页 |
| 3.2.8 利用流式细胞技术检测螺原体感染后3T6细胞的细胞凋亡 | 第68-69页 |
| 3.3 结果 | 第69-76页 |
| 3.3.1 SE-LsyoPL重组蛋白多克隆抗体制备与效价检测 | 第69-70页 |
| 3.3.2 螺原体总蛋白、膜蛋白和细胞质蛋白SDS-PAGE及Western blotting分析 | 第70-72页 |
| 3.3.3 土霉素法检测中华绒螯蟹螺原体S.eriocheiris侵染比例以及中和实验侵染结果 | 第72-73页 |
| 3.3.4 3T6细胞细胞培养与侵染结果 | 第73-75页 |
| 3.3.5 间接免疫荧光法标记定位结果 | 第75-76页 |
| 3.4 讨论 | 第76-79页 |
| 第四章 中华绒螯蟹螺原体生长特性及对精氨酸利用的研究 | 第79-92页 |
| 4.1 主要实验材料、仪器与试剂 | 第79-80页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第79页 |
| 4.1.2 主要仪器和耗材 | 第79-80页 |
| 4.1.3 主要试剂配方 | 第80页 |
| 4.2 实验方法 | 第80-83页 |
| 4.2.1 高效液相色谱法测定中华绒螯蟹螺原体对精氨酸的利用情况 | 第80-81页 |
| 4.2.2 中华绒螯蟹螺原体计数--颜色改变单位法(colour change unit,简称CCU) | 第81-82页 |
| 4.2.3 中华绒螯蟹螺原体生长曲线测定 | 第82页 |
| 4.2.4 温度对中华绒螯蟹螺原体生长的影响 | 第82页 |
| 4.2.5 pH对中华绒螯蟹螺原体生长的影响 | 第82页 |
| 4.2.6 培养基中添加精氨酸对对中华绒螯蟹螺原体生长的影响 | 第82-83页 |
| 4.3 结果 | 第83-90页 |
| 4.3.1 R8-1培养基中温度对中华绒螯蟹螺原体生长的影响 | 第83页 |
| 4.3.2 pH对中华绒螯蟹螺原体生长的影响 | 第83-84页 |
| 4.3.3 R8-1培养基中添加精氨酸对中华绒螯蟹螺原体生长的影响 | 第84-85页 |
| 4.3.4 高效液相色谱法测定中华绒螯蟹螺原体对精氨酸的利用情况 | 第85-90页 |
| 4.4 讨论 | 第90-92页 |
| 第五章 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,ADI)系统中关键基因的生物信息学分析及其克隆、表达纯化和功能的分析 | 第92-114页 |
| 5.1 材料 | 第93页 |
| 5.1.1 实验仪器 | 第93页 |
| 5.1.2 实验试剂 | 第93页 |
| 5.2 实验方法 | 第93-98页 |
| 5.2.1 序列分析 | 第93页 |
| 5.2.2 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取 | 第93页 |
| 5.2.3 螺原体培养 | 第93-94页 |
| 5.2.4 精氨酸脱亚胺酶中关键基因——精氨酸脱亚胺酶(ADI),鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)的PCR扩增 | 第94-95页 |
| 5.2.5 精氨酸脱亚胺酶(ADI),鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)基因与pUC19载体的连接 | 第95页 |
| 5.2.6 pUC-ADI,OTC和CK连接产物的转化 | 第95页 |
| 5.2.7 菌液PCR鉴定阳性克隆、测序分析 | 第95页 |
| 5.2.8 点突变实验 | 第95页 |
| 5.2.9 表达载体的构建 | 第95页 |
| 5.2.10 重组蛋白的表达与鉴定 | 第95页 |
| 5.2.11 Western blot分析蛋白表达结果确定目的蛋白诱导表达成功 | 第95页 |
| 5.2.12 Ni-NTA Agarose亲和层析 | 第95页 |
| 5.2.13 多克隆抗体的制备与效价检测 | 第95页 |
| 5.2.14 中华绒螯蟹螺原体螺原体总蛋白和膜蛋白的提取 | 第95页 |
| 5.2.15 RNA提取 | 第95-96页 |
| 5.2.16 去除DNA | 第96-97页 |
| 5.2.17 反转录 | 第97页 |
| 5.2.18 Real Time PCR反应 | 第97-98页 |
| 5.3 实验结果 | 第98-111页 |
| 5.3.1 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取,精氨酸脱亚胺酶(ADI),鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)基因PCR扩增及序列分析 | 第98-102页 |
| 5.3.2 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶系统中基因的点突变 | 第102页 |
| 5.3.3 原核表达载体的构建 | 第102页 |
| 5.3.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定 | 第102-103页 |
| 5.3.5 精氨酸脱亚胺酶(ADI),鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)重组蛋白多克隆抗体制备与效价检测及Western blotting分析 | 第103-105页 |
| 5.3.6 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶系统中基因Real time RTPCR分析 | 第105-110页 |
| 5.3.7 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶系统中关键酶在不同条件下蛋白表达量的分析 | 第110-111页 |
| 5.4 讨论 | 第111-114页 |
| 第六章 中华绒螯蟹螺原体鲱精胺脱亚胺酶(Agmatine deiminase,AgDI)系统中关键基因的生物信息学分析及其克隆、表达纯化和功能的分析 | 第114-128页 |
| 6.1 材料 | 第115页 |
| 6.1.1 实验仪器 | 第93-115页 |
| 6.1.2 实验试剂 | 第115页 |
| 6.2 实验方法 | 第115-117页 |
| 6.2.1 序列分析 | 第115页 |
| 6.2.2 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取 | 第115页 |
| 6.2.3 螺原体培养 | 第115页 |
| 6.2.4 鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)通路中关键基因——鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)的PCR扩增 | 第115-116页 |
| 6.2.5 鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)与pUC19载体的连接 | 第116页 |
| 6.2.6 pUC-AgDI和PTC连接产物的转化 | 第116页 |
| 6.2.7 菌液PCR鉴定阳性克隆、测序分析 | 第116页 |
| 6.2.8 点突变实验 | 第116页 |
| 6.2.9 表达载体的构建 | 第116页 |
| 6.2.10 重组蛋白的表达与鉴定 | 第116页 |
| 6.2.11 Western blot分析蛋白表达结果确定目的蛋白诱导表达成功 | 第116-117页 |
| 6.2.12 Ni-NTA Agarose亲和层析 | 第117页 |
| 6.2.13 多克隆抗体的制备与效价检测 | 第117页 |
| 6.2.14 RNA提取 | 第117页 |
| 6.2.15 去除DNA | 第117页 |
| 6.2.16 测量RNA浓度 | 第117页 |
| 6.2.17 反转录 | 第117页 |
| 6.2.18 Real Time PCR反应 | 第117页 |
| 6.3 实验结果 | 第117-126页 |
| 6.3.1 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取,鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)基因PCR扩增及序列分析 | 第117-120页 |
| 6.3.2 中华绒螯蟹螺原体AgDI系统中基因的点突变 | 第120页 |
| 6.3.3 原核表达载体的构建 | 第120页 |
| 6.3.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定 | 第120-121页 |
| 6.3.5 鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)重组蛋白多克隆抗体制备与效价检测 | 第121-122页 |
| 6.3.6 中华绒螯蟹螺原体鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)系统中基因Real timeRT-PCR分析 | 第122-125页 |
| 6.3.7 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶系统中关键酶在不同条件下蛋白表达量的分析 | 第125-126页 |
| 6.4 讨论 | 第126-128页 |
| 全文总结 | 第128-132页 |
| 参考文献 | 第132-146页 |
| 附录A | 第146-148页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149-150页 |
