| 摘要 | 第9-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 符号说明及缩写词 | 第15-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-32页 |
| 1.1 乳酸菌的概述 | 第16-18页 |
| 1.1.1 乳酸菌简介 | 第16-17页 |
| 1.1.2 乳酸杆菌 | 第17页 |
| 1.1.3 嗜热链球菌 | 第17-18页 |
| 1.2 γ氨基丁酸 | 第18-22页 |
| 1.2.1 γ氨基丁酸的简介 | 第18页 |
| 1.2.2 GABA的生理功能 | 第18-20页 |
| 1.2.3 GABA的代谢途径 | 第20-21页 |
| 1.2.4 产生GABA的乳酸菌 | 第21-22页 |
| 1.3 谷氨酸脱羧酶 | 第22-26页 |
| 1.3.1 谷氨酸脱羧酶概述 | 第22-23页 |
| 1.3.2 乳酸菌GAD的性质 | 第23-24页 |
| 1.3.3 乳酸菌GAD操纵子 | 第24-25页 |
| 1.3.4 乳酸菌GAD的功能 | 第25-26页 |
| 1.4 GABA的生产 | 第26-29页 |
| 1.4.1 化学合成法 | 第26页 |
| 1.4.2 植物富集法 | 第26-27页 |
| 1.4.3 微生物发酵法 | 第27-29页 |
| 1.5 GABA的检测 | 第29-31页 |
| 1.5.1 纸层析法 | 第29-30页 |
| 1.5.2 Berthelot比色法 | 第30页 |
| 1.5.3 氨基酸分析仪/高压液相色谱 | 第30-31页 |
| 1.6 本课题的研究思路与内容 | 第31-32页 |
| 第二章 生产GABA乳酸菌的筛选 | 第32-48页 |
| 2.1 前言 | 第32-33页 |
| 2.2 材料 | 第33-34页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第33页 |
| 2.2.2 试剂和培养基 | 第33页 |
| 2.2.3 材料和仪器 | 第33-34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-37页 |
| 2.3.1 菌株活化 | 第34页 |
| 2.3.2 生产GABA菌株的初步鉴定 | 第34-35页 |
| 2.3.3 粗酶液中谷氨酸脱羧酶酶活测定 | 第35页 |
| 2.3.4 乳酸菌染色体提取 | 第35-36页 |
| 2.3.5 序列引物设计 | 第36页 |
| 2.3.6 PCR扩增与产物纯化 | 第36页 |
| 2.3.7 E.coli DH5α感受态细胞的制备与转化 | 第36-37页 |
| 2.4 实验结果 | 第37-44页 |
| 2.4.1 GABA检测方法的确立 | 第37-39页 |
| 2.4.2 利用纸层析法进行菌种初筛 | 第39-41页 |
| 2.4.3 谷氨酸脱羧酶酶活测定 | 第41页 |
| 2.4.4 嗜热链球菌产生GABA能力的普遍性分析 | 第41-42页 |
| 2.4.5 序列检测与比对 | 第42-44页 |
| 2.5 小结与讨论 | 第44-48页 |
| 第三章 谷氨酸脱羧酶的酶学性质 | 第48-60页 |
| 3.1 引言 | 第48页 |
| 3.2 材料 | 第48-49页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第48-49页 |
| 3.2.2 试剂和培养基 | 第49页 |
| 3.2.3 材料和仪器 | 第49页 |
| 3.3 实验方法 | 第49-54页 |
| 3.3.1 gadB序列的表达引物设计与克隆 | 第49-50页 |
| 3.3.2 PCR体系与程序与产物的胶回收纯化 | 第50页 |
| 3.3.3 质粒构建 | 第50-51页 |
| 3.3.4 GAD的诱导表达 | 第51页 |
| 3.3.5 利用Ni~+柱进行蛋白的纯化 | 第51页 |
| 3.3.6 SDS-PAGE检测 | 第51-52页 |
| 3.3.7 GAD200和GAD201酶活测定 | 第52-53页 |
| 3.3.8 GAD201最适温度和最适PH的测定 | 第53页 |
| 3.3.9 GA201温度稳定性和pH稳定性的测定 | 第53页 |
| 3.3.10 GAD201的Km和Vmax值 | 第53页 |
| 3.3.11 金属离子及化合物对GAD201谷氨酸脱羧酶的影响 | 第53-54页 |
| 3.4 实验结果 | 第54-59页 |
| 3.4.0 载体构建 | 第54页 |
| 3.4.1 谷氨酸脱羧酶在E.coli中的表达与纯化 | 第54-56页 |
| 3.4.2 GAD201最适温度和最适PH的测定 | 第56-57页 |
| 3.4.3 GAD201温度、pH耐受性 | 第57页 |
| 3.4.4 金属离子及化合物对酶活的影响 | 第57-58页 |
| 3.4.5 GAD201的酶学系数 | 第58-59页 |
| 3.5 小结与讨论 | 第59-60页 |
| 第四章 酸胁迫条件下GAD对S.thermphilus SDMCC050201的保护作用 | 第60-76页 |
| 4.1 引言 | 第60页 |
| 4.2 材料 | 第60-61页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第60-61页 |
| 4.2.2 试剂和培养基 | 第61页 |
| 4.2.3 材料和仪器 | 第61页 |
| 4.3 实验方法 | 第61-66页 |
| 4.3.1 gadB上下游基因的克隆 | 第61-63页 |
| 4.3.2 敲除质粒的构建 | 第63页 |
| 4.3.3 乳酸菌质粒的提取 | 第63-64页 |
| 4.3.4 Lc.lactis感受态的制备与电转化 | 第64页 |
| 4.3.5 S thermphilus感受态的制备与电转化 | 第64-65页 |
| 4.3.6 gadB的基因敲除 | 第65-66页 |
| 4.3.7 S.thermphilus SDMCC050201与S.thermphilusSDMCC050201△gadB生长曲线的测定 | 第66页 |
| 4.3.8 S.thermphilus SDMCC050201与S.thermphilusSDMCC050201△gadB抗酸胁迫能力测定 | 第66页 |
| 4.4 实验结果 | 第66-73页 |
| 4.4.1 gadB上下游基因的克隆与载体构建 | 第66-69页 |
| 4.4.2 gadB的基因敲除 | 第69-70页 |
| 4.4.3 S.thermphilus SDMCC050201与S.thermphilusSDMCC050201△gadB生长差异的测定 | 第70-72页 |
| 4.4.4 S. thermphilus SDMCC050201与S.thermphilusSDMCC050201△gadB抗酸胁迫能力的测定 | 第72-73页 |
| 4.5 小结与讨论 | 第73-76页 |
| 第五章 利用 S. thermphilus SDMCC050201发酵生产富含GABA的酸奶 | 第76-84页 |
| 5.1 前言 | 第76页 |
| 5.2 材料 | 第76-77页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第76页 |
| 5.2.2 试剂和培养基 | 第76-77页 |
| 5.2.3 材料和仪器 | 第77页 |
| 5.3 实验方法 | 第77-78页 |
| 5.3.1 利用高压液相色谱定量测定GABA含量方法的建立 | 第77-78页 |
| 5.3.2 实验室规模的酸奶发酵 | 第78页 |
| 5.4 实验结果 | 第78-81页 |
| 5.4.1 定量测定GABA含量方法的建立 | 第78-79页 |
| 5.4.2 碳源对嗜热链球菌产生GABA的影响 | 第79-80页 |
| 5.4.3 富含GABA酸奶 | 第80-81页 |
| 5.5 小结与讨论 | 第81-84页 |
| 结论与展望 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第95页 |
