| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 前言 | 第14-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-33页 |
| 1.1 甘草酸及其衍生物 | 第15-18页 |
| 1.1.1 甘草酸的性质及应用 | 第15-16页 |
| 1.1.2 单葡萄糖醛酸基甘草次酸的性质及应用 | 第16-17页 |
| 1.1.3 甘草次酸的性质及应用 | 第17-18页 |
| 1.2 单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制备 | 第18-20页 |
| 1.2.1 化学法合成GAMG | 第18-19页 |
| 1.2.2 微生物法制备单葡萄糖醛酸甘草次酸 | 第19-20页 |
| 1.3 葡萄糖醛酸苷酶的研究进展 | 第20-25页 |
| 1.3.1 β-葡糖醛酸苷酶的结构 | 第21-23页 |
| 1.3.2 β-葡糖醛酸苷酶的催化机理 | 第23-24页 |
| 1.3.3 β-萄糖醛酸苷酶的底物及底物特异性 | 第24-25页 |
| 1.4 酶分子改造的研究进展 | 第25-31页 |
| 1.4.1 酶的理性设计 | 第25-27页 |
| 1.4.2 酶的非理性设计 | 第27-29页 |
| 1.4.3 突变体文库筛选技术 | 第29-30页 |
| 1.4.4 酶分子的半理性设计 | 第30页 |
| 1.4.5 酶分子改造的展望 | 第30-31页 |
| 1.5 论文的研究背景及研究内容 | 第31-33页 |
| 1.5.1 研究背景和意义 | 第31-32页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第32-33页 |
| 第2章 高效筛选 β-葡萄糖醛酸苷酶底物特异性表达系统的构建 | 第33-54页 |
| 引言 | 第33-34页 |
| 2.1 材料 | 第34-39页 |
| 2.1.1 菌种 | 第34页 |
| 2.1.2 质粒 | 第34-35页 |
| 2.1.3 引物合成与测序 | 第35-36页 |
| 2.1.4 培养基和主要溶液配置 | 第36-37页 |
| 2.1.5 药品试剂 | 第37-38页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第38-39页 |
| 2.2 方法 | 第39-45页 |
| 2.2.1 培养条件 | 第39页 |
| 2.2.2 质粒DNA的提取 | 第39-40页 |
| 2.2.3 PCR产物的纯化和回收 | 第40页 |
| 2.2.4 Red同源重组系统的引物设计及验证 | 第40-42页 |
| 2.2.5 热击用大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第42页 |
| 2.2.6 Red同源重组系统电转感受态的制备及转化 | 第42-43页 |
| 2.2.7 pKD46和Cmr抗性基因的消除 | 第43页 |
| 2.2.8 β-葡萄糖醛酸苷酶酶活测定方法 | 第43-45页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第45-53页 |
| 2.3.1 构建E.coli DH5a的uidA基因缺失菌株 | 第45-47页 |
| 2.3.2 酶学验证uidA基因敲除 | 第47-48页 |
| 2.3.3 One-pot高效筛选载体的构建 | 第48-51页 |
| 2.3.4 不同启动子对 β-葡萄糖醛酸苷酶表达的影响 | 第51-52页 |
| 2.3.5 温度对噬菌体裂解酶裂解效率的影响 | 第52-53页 |
| 2.4 小结 | 第53-54页 |
| 第3章 定向进化改造 β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性 | 第54-72页 |
| 引言 | 第54-55页 |
| 3.1 材料 | 第55-57页 |
| 3.1.1 菌种 | 第55页 |
| 3.1.2 质粒 | 第55页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第55-56页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第56-57页 |
| 3.1.5 培养基和主要溶液配置 | 第57页 |
| 3.2 方法 | 第57-62页 |
| 3.2.1 培养条件 | 第57页 |
| 3.2.2 质粒DNA的提取 | 第57-58页 |
| 3.2.3 PCR产物的纯化和回收 | 第58页 |
| 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第58页 |
| 3.2.5 引物合成与测序 | 第58页 |
| 3.2.6 β-葡萄糖醛酸苷酶随机突变文库的构建 | 第58-60页 |
| 3.2.7 β-葡萄糖醛酸苷酶突变体的表达和筛选 | 第60-61页 |
| 3.2.8 突变酶的表达和纯化 | 第61-62页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第62-70页 |
| 3.3.1 突变文库的构建 | 第62-64页 |
| 3.3.2 基于96孔板的突变酶的筛选 | 第64-65页 |
| 3.3.3 β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）结构模拟 | 第65-69页 |
| 3.3.4 突变酶突变位点分析 | 第69-70页 |
| 3.4 小结 | 第70-72页 |
| 第4章 半理性改造 β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性 | 第72-97页 |
| 引言 | 第72-73页 |
| 4.1 材料 | 第73-75页 |
| 4.1.1 菌种 | 第73页 |
| 4.1.2 质粒 | 第73页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第73-74页 |
| 4.1.4 主要仪器 | 第74-75页 |
| 4.1.5 培养基和主要溶液配置 | 第75页 |
| 4.2 方法 | 第75-81页 |
| 4.2.1 培养条件 | 第75页 |
| 4.2.2 质粒DNA的提取 | 第75页 |
| 4.2.3 PCR产物的纯化和回收 | 第75-76页 |
| 4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第76页 |
| 4.2.5 引物合成与测序 | 第76-78页 |
| 4.2.6 饱和突变文库的构建 | 第78-79页 |
| 4.2.7 甘草酸、GAMG和葡糖醛酸分子结构文件的准备 | 第79页 |
| 4.2.8 PGUS-E晶体X-射线衍射、数据收集及结构解析 | 第79页 |
| 4.2.9 分子对接程序 | 第79-80页 |
| 4.2.10 PGUS-E突变体的表达和筛选 | 第80页 |
| 4.2.11 PGUS-E突变酶的表达和纯化 | 第80页 |
| 4.2.12 PGUS-E酶学动力学参数测定 | 第80-81页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第81-96页 |
| 4.3.1 β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）催化位点及催化.袋的确定 | 第81-86页 |
| 4.3.2 β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）饱和突变文库的构建及筛选 | 第86-89页 |
| 4.3.3 Arg563位点对底物特异性的影响 | 第89-90页 |
| 4.3.4 Ala365位点对底物特异性的影响 | 第90-91页 |
| 4.3.5 Ala365和Arg563组合突变对底物特异性的影响 | 第91-93页 |
| 4.3.6 突变体底物特异性改变的机理 | 第93-94页 |
| 4.3.7 突变酶的酶学性质及动力学分析 | 第94-96页 |
| 4.4.小结 | 第96-97页 |
| 第5章 β-葡萄糖醛酸苷酶的核酸适配体的筛选及固定化应用 | 第97-116页 |
| 引言 | 第97-98页 |
| 5.1 材料 | 第98-100页 |
| 5.1.1 菌种 | 第98页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第98-99页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第99-100页 |
| 5.1.4 培养基和主要溶液配置 | 第100页 |
| 5.2 方法 | 第100-106页 |
| 5.2.1 重组蛋白的诱导表达、纯化 | 第100-101页 |
| 5.2.2 SELEX筛选适配体流程 | 第101-103页 |
| 5.2.3 ssDNA文库的制备 | 第103-104页 |
| 5.2.4 ssDNA文库在SELEX中的反筛选 | 第104页 |
| 5.2.5 Aptamer的克隆与测序 | 第104-105页 |
| 5.2.6 靶分子与ssDNA之间相对亲和力的表征 | 第105页 |
| 5.2.7 适配体捕获靶分子 | 第105-106页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第106-115页 |
| 5.3.1 重组 β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）的表达纯化 | 第106-108页 |
| 5.3.2 SELEX筛选PCR条件优化及单链ssDNA制备 | 第108-110页 |
| 5.3.3 克隆与测序及适配体结构分析 | 第110-113页 |
| 5.3.4 靶分子与核酸适配体的复筛及亲和力测定 | 第113页 |
| 5.3.5 Apt5核酸适配体的特异性捕捉靶分子的测定 | 第113-114页 |
| 5.3.6 Apt5固定化PGUS-E使用次数及再生的测定 | 第114-115页 |
| 5.4 小结 | 第115-116页 |
| 第6章 结论与展望 | 第116-118页 |
| 6.1 结论 | 第116-117页 |
| 6.2 创新点 | 第117页 |
| 6.3 展望 | 第117-118页 |
| 参考文献 | 第118-128页 |
| 附录 | 第128-130页 |
| 攻读学位期间发表论文与研究成果清单 | 第130-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
| 作者简介 | 第132页 |
