| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 第一章 绪论 | 第11-29页 |
| 1.1 引言 | 第11页 |
| 1.2 SAM的理化性质 | 第11-12页 |
| 1.2.1 SAM的结构分析 | 第11-12页 |
| 1.2.2 SAM的稳定性 | 第12页 |
| 1.3 SAM的生理功能 | 第12-13页 |
| 1.3.1 转甲基作用 | 第12页 |
| 1.3.2 转硫作用 | 第12-13页 |
| 1.3.3 转氨丙基作用 | 第13页 |
| 1.4 SAM的应用领域和市场前景 | 第13页 |
| 1.4.1 SAM的应用领域 | 第13页 |
| 1.4.2 SAM的市场前景 | 第13页 |
| 1.5 微生物生产SAM的研究进展 | 第13-17页 |
| 1.5.1 高产SAM菌株的理性化筛选育种 | 第14-15页 |
| 1.5.3 代谢工程改造菌种提高SAM发酵产量的研究 | 第15-16页 |
| 1.5.4 SAM研究与生产的前景和展望 | 第16-17页 |
| 1.6 D-氨基酸氧化酶的研究进展 | 第17-19页 |
| 1.6.1 D-氨基酸氧化酶的来源 | 第17页 |
| 1.6.2 D-氨基酸氧化酶的性质 | 第17-19页 |
| 1.7 L-苯丙氨酸脱氢酶的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.7.1 L-苯丙氨酸脱氢酶的性质 | 第19页 |
| 1.7.2 L-苯丙氨酸脱氢酶的应用 | 第19-20页 |
| 1.8 酿酒酵母中标记回收的基因敲除技术 | 第20-23页 |
| 1.8.1 酿酒酵母中基因敲除技术 | 第20-21页 |
| 1.8.2 标记回收的基因敲除技术 | 第21-23页 |
| 1.9 CRISPR/Cas9基因组编辑系统的研究进展 | 第23-27页 |
| 1.9.1 CRISPR/Cas系统的来源及分类 | 第23-24页 |
| 1.9.2 CRISPR/Cas9的作用机制 | 第24-25页 |
| 1.9.3 CRISPR/Cas9系统的应用与展望 | 第25-27页 |
| 1.10 本工作研究的基本思路及拟研究内容 | 第27-29页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第29-37页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第29页 |
| 2.2 仪器与试剂 | 第29-30页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第29-30页 |
| 2.2.2 工具酶及主要试剂 | 第30页 |
| 2.3 培养基和培养条件 | 第30-31页 |
| 2.3.1 酵母培养基 | 第30-31页 |
| 2.3.2 酵母培养条件 | 第31页 |
| 2.3.3 大肠杆菌培养基及培养条件 | 第31页 |
| 2.4 大肠杆菌中的分子克隆实验 | 第31-32页 |
| 2.4.1 大肠杆菌质粒的抽提 | 第31页 |
| 2.4.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.4.3 大肠杆菌的转化 | 第32页 |
| 2.4.4 DNA纯化回收 | 第32页 |
| 2.5 酿酒酵母的转化 | 第32-33页 |
| 2.6 分析检测方法 | 第33-37页 |
| 2.6.1 细胞密度测定 | 第33页 |
| 2.6.2 细胞干重测定 | 第33页 |
| 2.6.5 发酵液中D-甲硫氨酸浓度的测定 | 第33-37页 |
| 第三章 改造菌提高胞内D-甲硫氨酸的积累量 | 第37-49页 |
| 3.1 引言 | 第37页 |
| 3.2 材料与方法 | 第37-43页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第37页 |
| 3.2.2 工具酶及主要试剂 | 第37-38页 |
| 3.2.3 大肠杆菌质粒的提取及转化 | 第38页 |
| 3.2.4 酿酒酵母基因组的提取 | 第38页 |
| 3.2.5 酿酒酵母质粒的转化 | 第38页 |
| 3.2.6 培养基与培养条件 | 第38页 |
| 3.2.7 BY4741中的基因敲除 | 第38-40页 |
| 3.2.8 BY4741胞内外D-甲硫氨酸、N-乙酰-D-甲硫氨酸的检测 | 第40-43页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第43-48页 |
| 3.3.1 敲除hpa3基因 | 第43页 |
| 3.3.2 D-甲硫氨酸对重组菌生长的影响 | 第43-45页 |
| 3.3.3 敲除hpa3基因有利于D-甲硫氨酸在酵母细胞内的累积 | 第45-48页 |
| 3.4 小结 | 第48-49页 |
| 第四章 D-氨基酸氧化酶和L-苯丙氨酸还原酶的酶活性研究 | 第49-67页 |
| 4.1 引言 | 第49页 |
| 4.2 材料和方法 | 第49-57页 |
| 4.2.1 实验菌株 | 第49页 |
| 4.2.2 培养基与培养条件 | 第49-50页 |
| 4.2.3 大肠杆菌质粒的提取及转化 | 第50页 |
| 4.2.4 酿酒酵母质粒的转化 | 第50页 |
| 4.2.5 酿酒酵母基因组的提取 | 第50页 |
| 4.2.6 目的基因的合成 | 第50-52页 |
| 4.2.7 重组质粒pR426的构建 | 第52-55页 |
| 4.2.8 细胞干重测定 | 第55页 |
| 4.2.9 粗酶液缓冲液的制备 | 第55-56页 |
| 4.2.10 胞内D-氨基酸氧化酶酶活测定 | 第56页 |
| 4.2.11 胞内L-苯丙氨酸脱氢酶酶活测定 | 第56-57页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第57-66页 |
| 4.3.1 构建重组质粒pR426 | 第57-60页 |
| 4.3.2 D-甲硫氨酸催化菌株的构建及筛选 | 第60页 |
| 4.3.3 D-氨基酸氧化酶及L-苯丙氨酸脱氢酶的表达 | 第60-61页 |
| 4.3.4 胞内D-氨基酸氧化酶酶活测定 | 第61-63页 |
| 4.3.5 胞内L-苯丙氨酸脱氢酶酶活测定 | 第63-66页 |
| 4.4 小结 | 第66-67页 |
| 第五章 利用改造菌合成SAM的研究 | 第67-75页 |
| 5.1 引言 | 第67页 |
| 5.2 材料与方法 | 第67-69页 |
| 5.2.1 实验菌种 | 第67页 |
| 5.2.2 培养基与培养条件 | 第67页 |
| 5.2.3 细胞干重测定 | 第67-68页 |
| 5.2.4 发酵液中SAM浓度的测定 | 第68-69页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第69-73页 |
| 5.3.1 改造菌株利用DL-甲硫氨酸生产SAM | 第69-70页 |
| 5.3.2 100mL摇瓶发酵进一步验证R-BY4741利用D-甲硫氨酸生产SAM | 第70-73页 |
| 5.4 小结 | 第73-75页 |
| 第六章 利用CRISPR/Cas9系统对BY4741进行基因编辑 | 第75-89页 |
| 6.1 引言 | 第75页 |
| 6.2 材料和方法 | 第75-81页 |
| 6.2.1 实验菌株及质粒 | 第75页 |
| 6.2.2 培养基与培养条件 | 第75-76页 |
| 6.2.3 大肠杆菌质粒的提取及转化 | 第76页 |
| 6.2.4 酿酒酵母电转感受态制备方法和电转化方法 | 第76页 |
| 6.2.5 酿酒酵母基因组的提取 | 第76-77页 |
| 6.2.6 gRNA转录质粒p426的构建 | 第77-79页 |
| 6.2.7 重组片段的合成 | 第79-80页 |
| 6.2.8 Cas9蛋白的表达 | 第80-81页 |
| 6.3 实验结果与讨论 | 第81-87页 |
| 6.3.1 利用CRISPR/Cas9系统敲除erg6基因 | 第81-82页 |
| 6.3.2 利用CRISPR/Cas9系统与重组片段敲除hpa3基因 | 第82-84页 |
| 6.3.3 通过CRISPR/Cas9系统将hpa3基因替换成G418抗性基因 | 第84-87页 |
| 6.4 小节 | 第87-89页 |
| 第七章 结论与展望 | 第89-91页 |
| 7.1 结论 | 第89-90页 |
| 7.2 展望 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-97页 |
