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细菌发酵生产高光学纯乳酸单体的机理研究

摘要第5-6页
ABSTRACT第6-7页
1 前言第10-19页
    1.1 乳酸第10-12页
        1.1.1 乳酸的结构与性质第10页
        1.1.2 乳酸的应用第10-12页
        1.1.3 乳酸的生产方法第12页
    1.2 乳酸代谢关键酶第12-13页
        1.2.1 NAD-依赖型L-/D-乳酸脱氢酶(L-/D-nLDH)第12页
        1.2.2 NAD-非依赖型乳酸脱氢酶(iLDH)第12-13页
        1.2.3 乳酸消旋酶第13页
    1.3 乳酸基因工程菌株构建的进展及国内外研究现状第13-15页
        1.3.1 乳酸菌第13-14页
        1.3.2 大肠杆菌第14页
        1.3.3 酵母菌第14-15页
    1.4 凝结芽孢杆菌中L-乳酸的合成第15-17页
        1.4.1 凝结芽孢杆菌简介第15页
        1.4.2 凝结芽孢杆菌中L-乳酸的合成途径第15-16页
        1.4.3 凝结芽孢杆菌基因敲除第16-17页
        1.4.4 凝结芽孢杆菌基因改造研究现状第17页
    1.5 本课题的研究意义及内容第17-19页
2 材料与方法第19-38页
    2.1 实验材料第19-24页
        2.1.1 菌种、质粒及引物第19-22页
        2.1.2 主要试剂第22页
        2.1.3 主要仪器设备第22-23页
        2.1.4 培养基第23-24页
        2.1.5 培养条件第24页
    2.2 实验方法第24-38页
        2.2.1 生长曲线和乳酸光学纯度的测定第24页
        2.2.2 大肠杆菌表达载体的构建第24-27页
        2.2.3 重组蛋白的表达与纯化第27-29页
        2.2.4 重组蛋白的体外酶活检测第29-30页
        2.2.5 重组蛋白的体内酶活检测第30页
        2.2.6 实时荧光定量PCR(Real Time PCR, RT-PCR)分析第30-32页
        2.2.7 乳酸代谢关键酶的基因敲除和回补第32-37页
        2.2.8 分析方法第37-38页
3 结果与讨论第38-56页
    3.1 两株菌生长曲线和乳酸光学纯度差异第38页
    3.2 乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的异源表达第38-40页
        3.2.1 基因组的提取第38-39页
        3.2.2 目的基因的PCR扩增第39-40页
        3.2.3 表达载体构建验证第40页
    3.3 重组蛋白纯化第40页
    3.4 重组蛋白的酶学性质第40-43页
        3.4.1 最适反应pH第40页
        3.4.2 最适反应温度的确定第40-42页
        3.4.3 乳酸脱氢酶动力学参数的分析第42-43页
    3.5 粗酶液的Native-Page分析第43-44页
    3.6 关键酶的转录水平差异分析第44-46页
        3.6.1 RNA提取结果第44页
        3.6.2 cDNA的合成第44-45页
        3.6.3 不同关键酶相同发酵时期转录水平的比较结果第45-46页
        3.6.4 相同关键酶不同发酵时期转录水平的比较分析第46页
    3.7 关键酶的基因敲除与回补第46-56页
        3.7.1 电转化条件的优化第46-48页
        3.7.2 乳酸脱氢酶基因的敲除第48-49页
        3.7.3 关键酶基因的敲除第49-51页
        3.7.4 关键酶基因的回补第51-52页
        3.7.5 各突变菌株的发酵特性第52-54页
        3.7.6 各突变菌株的体内酶活第54-56页
4 结论第56-58页
5 展望第58-59页
6 参考文献第59-66页
7 攻读硕士学位期间发表论文情况第66-67页
8 致谢第67页

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