| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第10-19页 |
| 1.1 乳酸 | 第10-12页 |
| 1.1.1 乳酸的结构与性质 | 第10页 |
| 1.1.2 乳酸的应用 | 第10-12页 |
| 1.1.3 乳酸的生产方法 | 第12页 |
| 1.2 乳酸代谢关键酶 | 第12-13页 |
| 1.2.1 NAD-依赖型L-/D-乳酸脱氢酶(L-/D-nLDH) | 第12页 |
| 1.2.2 NAD-非依赖型乳酸脱氢酶(iLDH) | 第12-13页 |
| 1.2.3 乳酸消旋酶 | 第13页 |
| 1.3 乳酸基因工程菌株构建的进展及国内外研究现状 | 第13-15页 |
| 1.3.1 乳酸菌 | 第13-14页 |
| 1.3.2 大肠杆菌 | 第14页 |
| 1.3.3 酵母菌 | 第14-15页 |
| 1.4 凝结芽孢杆菌中L-乳酸的合成 | 第15-17页 |
| 1.4.1 凝结芽孢杆菌简介 | 第15页 |
| 1.4.2 凝结芽孢杆菌中L-乳酸的合成途径 | 第15-16页 |
| 1.4.3 凝结芽孢杆菌基因敲除 | 第16-17页 |
| 1.4.4 凝结芽孢杆菌基因改造研究现状 | 第17页 |
| 1.5 本课题的研究意义及内容 | 第17-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-24页 |
| 2.1.1 菌种、质粒及引物 | 第19-22页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第22-23页 |
| 2.1.4 培养基 | 第23-24页 |
| 2.1.5 培养条件 | 第24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-38页 |
| 2.2.1 生长曲线和乳酸光学纯度的测定 | 第24页 |
| 2.2.2 大肠杆菌表达载体的构建 | 第24-27页 |
| 2.2.3 重组蛋白的表达与纯化 | 第27-29页 |
| 2.2.4 重组蛋白的体外酶活检测 | 第29-30页 |
| 2.2.5 重组蛋白的体内酶活检测 | 第30页 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR(Real Time PCR, RT-PCR)分析 | 第30-32页 |
| 2.2.7 乳酸代谢关键酶的基因敲除和回补 | 第32-37页 |
| 2.2.8 分析方法 | 第37-38页 |
| 3 结果与讨论 | 第38-56页 |
| 3.1 两株菌生长曲线和乳酸光学纯度差异 | 第38页 |
| 3.2 乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的异源表达 | 第38-40页 |
| 3.2.1 基因组的提取 | 第38-39页 |
| 3.2.2 目的基因的PCR扩增 | 第39-40页 |
| 3.2.3 表达载体构建验证 | 第40页 |
| 3.3 重组蛋白纯化 | 第40页 |
| 3.4 重组蛋白的酶学性质 | 第40-43页 |
| 3.4.1 最适反应pH | 第40页 |
| 3.4.2 最适反应温度的确定 | 第40-42页 |
| 3.4.3 乳酸脱氢酶动力学参数的分析 | 第42-43页 |
| 3.5 粗酶液的Native-Page分析 | 第43-44页 |
| 3.6 关键酶的转录水平差异分析 | 第44-46页 |
| 3.6.1 RNA提取结果 | 第44页 |
| 3.6.2 cDNA的合成 | 第44-45页 |
| 3.6.3 不同关键酶相同发酵时期转录水平的比较结果 | 第45-46页 |
| 3.6.4 相同关键酶不同发酵时期转录水平的比较分析 | 第46页 |
| 3.7 关键酶的基因敲除与回补 | 第46-56页 |
| 3.7.1 电转化条件的优化 | 第46-48页 |
| 3.7.2 乳酸脱氢酶基因的敲除 | 第48-49页 |
| 3.7.3 关键酶基因的敲除 | 第49-51页 |
| 3.7.4 关键酶基因的回补 | 第51-52页 |
| 3.7.5 各突变菌株的发酵特性 | 第52-54页 |
| 3.7.6 各突变菌株的体内酶活 | 第54-56页 |
| 4 结论 | 第56-58页 |
| 5 展望 | 第58-59页 |
| 6 参考文献 | 第59-66页 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第66-67页 |
| 8 致谢 | 第67页 |
