| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-15页 |
| 缩略词表 | 第15-16页 |
| 1 文献综述 | 第16-41页 |
| ·黄曲霉菌 | 第16-21页 |
| ·黄曲霉菌的分布和危害 | 第16-17页 |
| ·黄曲霉菌病害的侵染循环及发生流行 | 第17页 |
| ·黄曲霉菌的致病因子 | 第17-19页 |
| ·黄曲霉菌的防治 | 第19-21页 |
| ·抗病育种与抗性资源开发 | 第19-20页 |
| ·生物防治 | 第20页 |
| ·储藏期防治 | 第20-21页 |
| ·黄曲霉毒素 | 第21-27页 |
| ·黄曲霉毒素的来源及危害 | 第21-22页 |
| ·黄曲霉毒素的生物合成 | 第22-25页 |
| ·黄曲霉毒素的毒理学研究 | 第25-27页 |
| ·单克隆抗体 | 第27-32页 |
| ·免疫球蛋白概述 | 第27-29页 |
| ·单克隆抗体研究进展 | 第29-30页 |
| ·单克隆抗体的应用 | 第30-32页 |
| ·基因工程抗体 | 第32-36页 |
| ·基因工程概述 | 第32-34页 |
| ·功能抗体和双特异抗体 | 第34页 |
| ·单链抗体表达系统 | 第34-36页 |
| ·噬菌体展示与重组抗体库 | 第36-39页 |
| ·丝状噬菌体介绍 | 第36-37页 |
| ·噬菌体展示介绍 | 第37-38页 |
| ·噬菌体抗体库介绍 | 第38-39页 |
| ·黄曲霉菌检测方法 | 第39-41页 |
| 2 研究目的和意义 | 第41-42页 |
| 3 黄曲霉菌特异单克隆抗体的筛选 | 第42-56页 |
| ·实验材料 | 第42-45页 |
| ·菌株、细胞株 | 第42页 |
| ·实验动物 | 第42页 |
| ·主要试剂和耗材 | 第42-43页 |
| ·试剂配制 | 第43-45页 |
| ·细胞培养有关试剂配制 | 第43页 |
| ·抗原制备有关试剂配制 | 第43-44页 |
| ·单克隆抗体纯化有关溶液配制 | 第44页 |
| ·ELISA有关溶液配制 | 第44页 |
| ·SDS-PAGE有关溶液配制 | 第44-45页 |
| ·仪器设备 | 第45页 |
| ·实验方法 | 第45-50页 |
| ·抗原制备 | 第45-46页 |
| ·动物免疫 | 第46页 |
| ·抗血清效价检测 | 第46页 |
| ·骨髓瘤细胞培养 | 第46-47页 |
| ·饲养层细胞制备 | 第47页 |
| ·免疫脾淋巴细胞制备 | 第47页 |
| ·细胞融合 | 第47-48页 |
| ·杂交瘤细胞的筛选 | 第48页 |
| ·杂交瘤细胞亚克隆 | 第48页 |
| ·杂交瘤细胞的冻存 | 第48-49页 |
| ·杂交瘤细胞的复苏 | 第49页 |
| ·单克隆抗体的生产 | 第49页 |
| ·单克隆抗体的纯化 | 第49页 |
| ·单克隆抗体SDS-PAGE电泳检测 | 第49-50页 |
| ·单克隆抗体亲和力的鉴定 | 第50页 |
| ·结果与分析 | 第50-54页 |
| ·黄曲霉细胞壁蛋白制备 | 第50-51页 |
| ·免疫后抗血清滴度检测 | 第51-52页 |
| ·杂交瘤细胞建株 | 第52页 |
| ·大量生产单克隆抗体 | 第52-53页 |
| ·纯化后单克隆抗体效价测定 | 第53-54页 |
| ·讨论 | 第54-56页 |
| ·黄曲霉菌抗原的制备 | 第54-55页 |
| ·黄曲霉菌特异单克隆抗体的筛选 | 第55-56页 |
| 4 黄曲霉菌特异单链抗体的筛选 | 第56-108页 |
| ·实验材料 | 第56-59页 |
| ·菌株及质粒 | 第56页 |
| ·实验动物 | 第56页 |
| ·主要试剂和耗材 | 第56-57页 |
| ·培养基及抗生素的配制 | 第57页 |
| ·缓冲液的配制 | 第57-59页 |
| ·质粒抽提和DNA电泳缓冲液 | 第57-58页 |
| ·感受态制备相关缓冲液 | 第58页 |
| ·噬菌体库淘选相关缓冲液 | 第58页 |
| ·蛋白表达和纯化缓冲液 | 第58-59页 |
| ·引物序列 | 第59页 |
| ·主要仪器设备 | 第59页 |
| ·实验方法 | 第59-75页 |
| ·抗原制备 | 第59页 |
| ·动物免疫及多抗制备 | 第59-60页 |
| ·来亨母鸡免疫 | 第59-60页 |
| ·IgY多克隆抗体制备 | 第60页 |
| ·抗血清效价检测 | 第60页 |
| ·单链抗体基因克隆 | 第60-64页 |
| ·脾脏和骨髓总RNA提取 | 第60-61页 |
| ·mRNA纯化 | 第61页 |
| ·逆转录合成cDNA | 第61-62页 |
| ·抗体可变基因扩增 | 第62页 |
| ·小量构建重组噬菌粒 | 第62-63页 |
| ·大肠杆菌电转化感受态细胞制备 | 第63-64页 |
| ·连接和转化效率检测 | 第64页 |
| ·单链抗体基因鉴定 | 第64-65页 |
| ·煮沸裂解法提取质粒DNA | 第64-65页 |
| ·重组噬菌粒阳性率鉴定 | 第65页 |
| ·单链抗体基因多样性鉴定 | 第65页 |
| ·单链抗体基因文库构建 | 第65-66页 |
| ·大量构建重组噬菌粒 | 第65页 |
| ·重组噬菌粒转化E.coli XL1-Blue | 第65-66页 |
| ·单链抗体噬菌体展示库的构建和淘选 | 第66-68页 |
| ·辅助噬菌体扩增 | 第66页 |
| ·辅助噬菌体滴度测定 | 第66-67页 |
| ·单链抗体噬菌体库制备 | 第67页 |
| ·单链抗体噬菌体库滴度测度 | 第67-68页 |
| ·单链抗体噬菌体库的淘选 | 第68页 |
| ·特异性单链抗体鉴定 | 第68-69页 |
| ·表达ELISA鉴定特异性单链抗体 | 第68-69页 |
| ·黄曲霉菌特异单链抗体序列分析 | 第69页 |
| ·单链抗体的表达与纯化 | 第69-71页 |
| ·大肠杆菌热激感受态制备 | 第69-70页 |
| ·重组噬菌粒转化表达宿主 | 第70页 |
| ·单链抗体表达菌株鉴定 | 第70页 |
| ·单链抗体大量表达与纯化 | 第70-71页 |
| ·单链抗体的亲和力比较 | 第71-72页 |
| ·单链抗体对菌丝亲和力的比较 | 第71-72页 |
| ·单链抗体对孢子亲和力的比较 | 第72页 |
| ·单链抗体空间结构模拟 | 第72页 |
| ·免疫荧光分析 | 第72-73页 |
| ·噬菌体展示库的重新淘选 | 第73-74页 |
| ·单链抗体噬菌体库的扩增 | 第73-74页 |
| ·单链抗体噬菌体库重新筛选 | 第74页 |
| ·重新淘选后特异性单链抗体鉴定 | 第74-75页 |
| ·Phage ELISA鉴定特异性单链抗体 | 第74页 |
| ·特异单链抗体序列分析 | 第74-75页 |
| ·结果与分析 | 第75-103页 |
| ·动物免疫及IgY多抗制备 | 第75-76页 |
| ·免疫后鸡抗血清滴度检测 | 第75页 |
| ·IgY多抗的制备 | 第75-76页 |
| ·IgY多抗效价测定 | 第76页 |
| ·单链抗体基因克隆 | 第76-79页 |
| ·脾脏和骨髓总RNA提取及cDNA合成 | 第76-77页 |
| ·mRNA的纯化及cDNA合成 | 第77页 |
| ·抗体可变区及scFv基因扩增 | 第77-78页 |
| ·连接转化效率测试 | 第78-79页 |
| ·单链抗体基因鉴定 | 第79-80页 |
| ·ScFv插入片段阳性率检测 | 第79-80页 |
| ·ScFv基因多样性鉴定 | 第80页 |
| ·单链抗体基因文库构建 | 第80-81页 |
| ·ScFv噬菌体展示库的淘选 | 第81-82页 |
| ·辅助噬菌体的制备 | 第81页 |
| ·高亲和力scFv抗体的筛选 | 第81-82页 |
| ·特异性单链抗体鉴定 | 第82-87页 |
| ·表达ELISA鉴定 | 第82-84页 |
| ·黄曲霉菌特异单链抗体序列分析 | 第84-87页 |
| ·单链抗体的表达与纯化 | 第87-90页 |
| ·重组噬菌粒转化表达宿主 | 第87-89页 |
| ·单链抗体蛋白诱导表达和纯化 | 第89-90页 |
| ·黄曲霉菌特异单链抗体亲和力比较 | 第90-92页 |
| ·黄曲霉菌特异单链抗体空间结构模拟 | 第92-94页 |
| ·免疫荧光分析 | 第94-96页 |
| ·单链抗体噬菌体展示库再淘选 | 第96-103页 |
| ·单链抗体噬菌体展示库的繁殖与淘选 | 第96-97页 |
| ·Phage ELISA鉴定 | 第97-101页 |
| ·单链抗体AfPD12的表达纯化 | 第101页 |
| ·AfPD12亲和力分析及免疫荧光检测 | 第101-103页 |
| ·讨论 | 第103-108页 |
| ·鸡单链抗体库的特点 | 第103-104页 |
| ·鸡单链抗体库的构建和筛选 | 第104-106页 |
| ·单链抗体的表达与纯化 | 第106页 |
| ·单链抗体空间结构分析 | 第106-108页 |
| 5单链抗体融合蛋白的构建及应用 | 第108-138页 |
| ·实验材料 | 第108-109页 |
| ·菌株及质粒 | 第108页 |
| 5,1.2 主要仪器、试剂和耗材 | 第108页 |
| ·引物序列 | 第108页 |
| ·缓冲液及培养基配制 | 第108-109页 |
| ·实验方法 | 第109-118页 |
| ·ScFv-AP融合蛋白的构建 | 第109-111页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第109-110页 |
| ·PCR产物和载体的酶切与连接 | 第110-111页 |
| ·连接产物转化表达宿主菌 | 第111页 |
| ·Bio-AfPD12融合蛋白的构建 | 第111-112页 |
| ·AfPD12基因PCR扩增和酶切 | 第111-112页 |
| ·连接产物转化表达宿主菌 | 第112页 |
| ·ScFv-AP融合蛋白表达和纯化 | 第112页 |
| ·Bio-AfPD12蛋白表达和纯化 | 第112页 |
| ·Bio-AfPD12融合蛋白生物素化分析 | 第112-113页 |
| ·ScFv-AP融合蛋白活性检测 | 第113页 |
| ·ScFv及scFv-AP抗原结合分析 | 第113-114页 |
| ·Western blot分析抗原结合 | 第113页 |
| ·ELISA分析抗原结合特异性 | 第113-114页 |
| ·黄曲霉产毒菌株产毒能力测定 | 第114页 |
| ·表面等离子共振技术(SPR)分析抗体亲和力 | 第114-115页 |
| ·ELISA比较scFv和scFv-AP的亲和力 | 第115页 |
| ·不同抗体捕获抗原能力比较 | 第115-116页 |
| ·夹心ELISA最低定量限(LOQ)的确定 | 第116页 |
| ·夹心ELISA法检测自然发病的材料 | 第116页 |
| ·Bio-AfPD12融合蛋白活性分析 | 第116-117页 |
| ·荧光免疫吸附检测方法的建立 | 第117-118页 |
| ·结果与分析 | 第118-136页 |
| ·单链抗体与AP融合蛋白表达载体构建 | 第118页 |
| ·Bio-AfPD12融合蛋白表达载体构建 | 第118-119页 |
| ·ScFv-AP融合蛋白表达及纯化 | 第119-120页 |
| ·Bio-AfPD12表达和生物素化分析 | 第120-121页 |
| ·ScFv-AP融合蛋白活性检测 | 第121页 |
| ·ScFv及scFv-AP抗原结合分析 | 第121-126页 |
| ·Western blot分析抗原结合 | 第121-123页 |
| ·ELISA比较AfSA4和AfSA4-AP的亲和力 | 第123-124页 |
| ·ELISA分析scFv和scFv-AP结合特异性 | 第124-126页 |
| ·SPR测定抗体及融合蛋白的亲和力 | 第126-129页 |
| ·夹心ELISA检测方法的建立 | 第129-134页 |
| ·匹配AfSA4-AP的捕获抗体鉴定 | 第129-131页 |
| ·匹配AfPD12-AP的捕获抗体鉴定 | 第131-132页 |
| ·对样品检测的最低定量限的确定 | 第132-133页 |
| ·夹心ELISA方法对发病样品的检测 | 第133-134页 |
| ·Bio-AfPD12融合蛋白活性分析 | 第134-135页 |
| ·夹心荧光免疫吸附检测方法的建立 | 第135-136页 |
| ·讨论 | 第136-138页 |
| 6 参考文献 | 第138-161页 |
| 致谢 | 第161-162页 |
| 附录 | 第162页 |