| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-10页 |
| 引言 | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-23页 |
| ·青蒿素的生物合成研究概况 | 第12-15页 |
| ·青蒿素的生物合成途径 | 第12-13页 |
| ·共同步骤 | 第12页 |
| ·特异步骤 | 第12-13页 |
| ·青蒿素生物合成前体研究 | 第13页 |
| ·青蒿酸 | 第13页 |
| ·双氢青蒿酸 | 第13页 |
| ·青蒿素前体与青蒿素的关系 | 第13页 |
| ·青蒿素生物合成途径中的关键酶及其编码基因 | 第13-15页 |
| ·HMGR | 第13-14页 |
| ·FDPS | 第14页 |
| ·ADS | 第14页 |
| ·CYP71AV1 | 第14页 |
| ·DBR2 | 第14-15页 |
| ·ALDH1 | 第15页 |
| ·微生物合成青蒿素前体的研究 | 第15页 |
| ·酵母菌的研究概况 | 第15-18页 |
| ·酵母表达系统 | 第15-16页 |
| ·良酒酵母表达系统的优势 | 第16页 |
| ·良酒酵母表达载体 | 第16页 |
| ·影响酵母表达外源蛋白的因素 | 第16-18页 |
| ·外源基因特性 | 第16-17页 |
| ·启动子的影响 | 第17页 |
| ·酵母菌的分泌信号 | 第17页 |
| ·外源基因拷贝数和稳定性 | 第17-18页 |
| ·外源蛋白的糖基化 | 第18页 |
| ·表达条件的优化 | 第18页 |
| ·生物转化研究概况 | 第18-21页 |
| ·生物转化的定义 | 第18-19页 |
| ·生物转化的优点及特点 | 第19页 |
| ·专一性强 | 第19页 |
| ·反应条件温和 | 第19页 |
| ·副产物少、产量高 | 第19页 |
| ·生物转化在中药领域的应用 | 第19-21页 |
| ·开发中药新药 | 第19-20页 |
| ·提高中药有效成分的水溶性 | 第20页 |
| ·降低中药有效成分的毒性 | 第20页 |
| ·提高中药有效成分的活性 | 第20页 |
| ·改变中药有效成分的活性 | 第20-21页 |
| ·将无效中药成分转化为有效成分 | 第21页 |
| ·国内青蒿素的生物转化研究 | 第21页 |
| ·研究背景和设计思路 | 第21-23页 |
| 第二章 青蒿素前体合成基因克隆与酵母穿梭表达载体的构建 | 第23-32页 |
| ·材料 | 第23-24页 |
| ·菌种和质粒 | 第23页 |
| ·引物设计 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23页 |
| ·试剂和抗生素 | 第23页 |
| ·仪器 | 第23-24页 |
| ·方法 | 第24-29页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第24页 |
| ·质粒DNA提取 | 第24-25页 |
| ·基因克隆 | 第25页 |
| ·凝胶回收基因克隆产物 | 第25-26页 |
| ·质粒pESC-URA及CYP71AV1回收产物双酶切 | 第26页 |
| ·酶切回收产物连接 | 第26-27页 |
| ·连接产物的转化及重组载体鉴定 | 第27页 |
| ·质粒pESC-CYP71AV1及DBR2回收产物双酶切 | 第27-28页 |
| ·二次双酶切回收产物连接 | 第28页 |
| ·二次连接产物的转化及重组载体鉴定 | 第28页 |
| ·测序 | 第28-29页 |
| ·结果 | 第29-30页 |
| ·CYP71AV1、DBR2基因的扩增 | 第29页 |
| ·重组载体的酶切鉴定 | 第29-30页 |
| ·重组载体的PCR鉴定 | 第30页 |
| ·CYP71AV1、DBR2基因的重测序 | 第30页 |
| ·讨论 | 第30-32页 |
| 第三章 酵母转化、筛选、鉴定和半定量分析 | 第32-40页 |
| ·材料 | 第32-33页 |
| ·菌种和质粒 | 第32页 |
| ·引物 | 第32页 |
| ·培养基 | 第32页 |
| ·试剂及抗生素 | 第32-33页 |
| ·仪器 | 第33页 |
| ·方法 | 第33-36页 |
| ·酵母YPH501感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·重组载体pESC-CYP-DBR转化 | 第33页 |
| ·酵母质粒提取 | 第33-34页 |
| ·PCR扩增鉴定 | 第34页 |
| ·酵母工程菌感觉态细胞的制备 | 第34页 |
| ·pYES-ADS转化 | 第34页 |
| ·质粒提取及PCR鉴定 | 第34-35页 |
| ·酵母菌总RNA提取 | 第35页 |
| ·RT-PCR | 第35-36页 |
| ·结果 | 第36-39页 |
| ·酵母转化子的表型筛选 | 第36-37页 |
| ·酵母转化子中CYP71AV1、DBR2基因的PCR鉴定 | 第37-38页 |
| ·酵母工程菌ADS基因的PCR鉴定 | 第38页 |
| ·酵母工程菌CYP71AV1、DBR2、ADS mRNA的RT-PCR鉴定 | 第38-39页 |
| ·讨论 | 第39-40页 |
| 第四章 酵母工程菌发酵培养与发酵产物分析 | 第40-49页 |
| ·材料 | 第40页 |
| ·菌株 | 第40页 |
| ·试剂 | 第40页 |
| ·仪器 | 第40页 |
| ·方法 | 第40-41页 |
| ·酵母菌发酵培养 | 第40页 |
| ·酸化水相样品制备 | 第40-41页 |
| ·有机相样品制备 | 第41页 |
| ·GC-MS分析 | 第41页 |
| ·GC-MS定量 | 第41页 |
| ·结果 | 第41-47页 |
| ·酸化水相中发酵产物的GC-MS分析 | 第41-46页 |
| ·有机相中紫穗槐二烯的GC-MS分析及定量 | 第46-47页 |
| ·讨论 | 第47-49页 |
| 第五章 青蒿冷胁迫诱导及发酵产物的生物转化 | 第49-58页 |
| ·材料 | 第49-50页 |
| ·植物材料 | 第49页 |
| ·菌株 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·仪器 | 第49-50页 |
| ·方法 | 第50-51页 |
| ·酵母工程菌发酵及发酵产物提取 | 第50页 |
| ·青蒿无细胞提取液制备 | 第50页 |
| ·生物转化 | 第50页 |
| ·HPLC检测 | 第50-51页 |
| ·结果 | 第51-56页 |
| ·48h发酵产物的生物转化 | 第51-53页 |
| ·14d诱导发酵产物的生物转化 | 第53-56页 |
| ·菌体生长对生物转化后青蒿素含量的影响 | 第56页 |
| ·讨论 | 第56-58页 |
| 第六章 咪康唑与DMSO对ADS基因表达的影响 | 第58-63页 |
| ·材料 | 第58页 |
| ·菌株 | 第58页 |
| ·引物 | 第58页 |
| ·培养基 | 第58页 |
| ·试剂 | 第58页 |
| ·仪器 | 第58页 |
| ·方法 | 第58-59页 |
| ·酵母菌INVScI(ADS)处理 | 第58-59页 |
| ·生长量测定 | 第59页 |
| ·RNA提取和逆转录 | 第59页 |
| ·荧光定量PCR | 第59页 |
| ·结果 | 第59-62页 |
| ·咪康唑对ADS基因诱导的影响 | 第59-61页 |
| ·DMSO对ADS基因诱导的影响 | 第61-62页 |
| ·讨论 | 第62-63页 |
| 结语 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-68页 |
| 附录 | 第68-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
