| 致谢 | 第1-15页 |
| 摘要 | 第15-19页 |
| Abstract | 第19-23页 |
| 前言 | 第23-25页 |
| 第一部分 文献综述 | 第25-56页 |
| 第一章 捻转血矛线虫与捻转血矛线虫病 | 第26-42页 |
| 1 捻转血矛线虫病概述 | 第26-28页 |
| ·病原及其形态特征 | 第26页 |
| ·生活史 | 第26-27页 |
| ·流行病学 | 第27页 |
| ·临床症状 | 第27-28页 |
| ·病理变化 | 第28页 |
| 2 捻转血矛线虫生物化学与分子生物学研究进展 | 第28-31页 |
| ·线虫从营自由生活转变为寄生生活的基因表达差异 | 第28-29页 |
| ·发育过程中的发育调节蛋白 | 第29-30页 |
| ·发育过程中的信号转导 | 第30-31页 |
| 3 捻转血矛线虫保护性抗原研究进展 | 第31-34页 |
| ·隐蔽抗原(hidden antigen) | 第31-33页 |
| ·H11 | 第31-32页 |
| ·血矛线虫半乳糖糖蛋白复合物(Haemonchus galactose-containingglycoprotein complex.H-gal-GP) | 第32页 |
| ·半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease) | 第32-33页 |
| ·天然抗原 | 第33-34页 |
| ·成虫15/24 kDa ES抗原 | 第33页 |
| ·成虫66 kDa ES抗原 | 第33-34页 |
| ·捻转血矛线虫感染性三期幼虫表面抗原(Hc-sL3) | 第34页 |
| ·捻转血矛线虫组织蛋白酶L(Hc-CPL-1) | 第34页 |
| 4 捻转血矛线虫疫苗研制 | 第34-39页 |
| ·重组抗原的免疫保护效果 | 第34-35页 |
| ·疫苗开发中存在的主要困难 | 第35-36页 |
| ·利用抗原的重组形式不能取得与天然提取物同等的免疫保护效果 | 第36页 |
| ·免疫策略难以制定,免疫佐剂难以选择 | 第36页 |
| ·不同品种或年龄阶段的羊针对线虫抗原产生的应答反应差异大 | 第36页 |
| ·捻转血矛线虫疫苗研究的发展方向 | 第36-38页 |
| ·秀丽隐杆线虫作为表达系统大量制备疫苗候选抗原 | 第36-37页 |
| ·新的疫苗候选抗原的鉴定 | 第37-38页 |
| ·利用寄生性线虫的细胞系表达抗原 | 第38页 |
| ·结语 | 第38-39页 |
| 5 胃肠道蠕虫感染及免疫应答机制研究 | 第39-42页 |
| ·胃肠道蠕虫感染及免疫应答机制 | 第39-41页 |
| ·捻转血矛线虫感染诱导的免疫应答 | 第41-42页 |
| 第二章 秀丽隐杆线虫及其在寄生性线虫研究中的应用 | 第42-56页 |
| 1 秀丽隐杆线虫简介 | 第42-46页 |
| ·秀丽隐杆线虫的生物学特性 | 第42-43页 |
| ·秀丽隐杆线虫的基因组工程 | 第43-46页 |
| ·秀丽隐杆线虫基因组简介 | 第43-44页 |
| ·秀丽隐杆线虫的选择性剪接(alternative splicing) | 第44-45页 |
| ·秀丽隐杆线虫基因组数据库 | 第45-46页 |
| 2 秀丽隐杆线虫在寄生性线虫基因功能研究中的应用 | 第46-56页 |
| ·秀丽隐杆线虫的分类学地位 | 第46-49页 |
| ·利用RNAi技术进行基因功能分析 | 第49-53页 |
| ·利用RNAi鉴定基因 | 第49页 |
| ·秀丽隐杆线虫体内的RNAi | 第49-50页 |
| ·寄生性线虫体内的RNAi研究 | 第50-53页 |
| ·秀丽隐杆线虫在寄生性线虫基因功能研究中的应用 | 第53-56页 |
| ·药物抗性研究 | 第53-54页 |
| ·酶活性研究 | 第54-56页 |
| 第二部分 研究内容 | 第56-168页 |
| 第一章 捻转血矛线虫H11基因cDNA克隆及基因组结构分析 | 第57-75页 |
| 摘要 | 第57-58页 |
| 1 材料与方法 | 第58-64页 |
| ·虫体 | 第58页 |
| ·菌株与质粒 | 第58页 |
| ·工具酶与试剂 | 第58页 |
| ·主要仪器设备 | 第58-59页 |
| ·溶液配制 | 第59页 |
| ·H11 cDNA序列的RT-PCR扩增 | 第59-60页 |
| ·捻转血矛线虫ZJ株总RNA的提取 | 第59页 |
| ·用于扩增H11 cDNA序列的引物的设计 | 第59页 |
| ·H11基因的RT-PCR扩增 | 第59-60页 |
| ·捻转血矛线虫ZJ株H11基因的克隆 | 第60页 |
| ·H11基因组序列的获得 | 第60-64页 |
| ·捻转血矛线虫基因组DNA的提取 | 第60-61页 |
| ·用于扩增H11部分基因组序列的引物的设计 | 第61页 |
| ·利用长距离PCR技术扩增H11部分基因组序列 | 第61-62页 |
| ·用于基因步移技术的特异性引物的设计 | 第62页 |
| ·利用基因步移技术扩增获得H11基因组序列 | 第62-64页 |
| ·H11基因组序列分析 | 第64页 |
| 2 结果 | 第64-73页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第64页 |
| ·捻转血矛线虫ZJ株H11基因的克隆、PCR鉴定及酶切分析 | 第64-66页 |
| ·序列测定 | 第66-68页 |
| ·序列比对 | 第68页 |
| ·长距离PCR扩增获得的部分基因组序列分析 | 第68页 |
| ·利用基因步移技术获得基因组片段及其鉴定 | 第68-71页 |
| ·H11基因组序列分析 | 第71-73页 |
| 3 讨论 | 第73-75页 |
| 第二章 秀丽隐杆线虫转基因体系的建立 | 第75-100页 |
| 摘要 | 第75-76页 |
| 1 材料与方法 | 第76-85页 |
| ·材料 | 第76-77页 |
| ·秀丽隐杆线虫 | 第76页 |
| ·菌株与质粒 | 第76页 |
| ·工具酶与试剂 | 第76页 |
| ·主要仪器设备 | 第76-77页 |
| ·溶液配制 | 第77页 |
| ·秀丽隐杆线虫基因组DNA的提取 | 第77页 |
| ·引物设计 | 第77-78页 |
| ·重组表达载体的构建策略 | 第78页 |
| ·基于Act-1基因核心启动子表达载体的构建 | 第78-82页 |
| ·秀丽隐杆线虫Act-1基因启动子的克隆、测序 | 第78页 |
| ·秀丽隐杆线虫T07F10.1a基因3’UTR序列的克隆、测序 | 第78-80页 |
| ·SV40早期mRNA终止信号序列的PCR扩增、克隆及测序 | 第80-81页 |
| ·EGFP基因的PCR扩增 | 第81页 |
| ·以pBluescript SK+载体为骨架,秀丽隐杆线虫表达重组载体的构建 | 第81-82页 |
| ·以pEGFP-4.1载体为骨架,秀丽隐杆线虫表达重组载体的构建 | 第82页 |
| ·基于T07F10.1a核心启动子的表达载体的构建 | 第82-83页 |
| ·携带有EGFP基因的重组表达载体在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 | 第83-84页 |
| ·显微注射前所需器材的准备 | 第83页 |
| ·秀丽隐杆线虫显微注射用虫体的传代培养 | 第83页 |
| ·携带EGFP基因的重组表达质粒的制备 | 第83页 |
| ·携带EGFP基因的重组表达质粒的显微注射 | 第83-84页 |
| ·具有roller表型的转基因虫体的单虫PCR鉴定 | 第84页 |
| ·携带有EGFP基因的重组表达载体在Vero细胞中的转染试验 | 第84-85页 |
| 2 结果 | 第85-98页 |
| ·重组表达载体所需转录元件PCR产物的鉴定 | 第85-87页 |
| ·秀丽隐杆线虫Act-1基因核心启动子克隆的PCR鉴定及酶切分析 | 第85页 |
| ·秀丽隐杆线虫T07F10.1a基因3’UTR序列的PCR鉴定及酶切分析 | 第85-86页 |
| ·SV40早期mRNA终止信号序列的PCR鉴定及酶切分析 | 第86页 |
| ·EGFP基因的PCR扩增 | 第86-87页 |
| ·秀丽隐杆线虫T07F10.1a启动子克隆的PCR鉴定及酶切分析 | 第87页 |
| ·重组表达载体启动子序列测序及功能基序分析 | 第87-90页 |
| ·Act-1基因核心启动子转录相关基序分析 | 第87-88页 |
| ·T07F10.1a基因启动子转录相关基序分析 | 第88页 |
| ·T07F10.1a基因3’UTR序列转录相关基序分析 | 第88页 |
| ·SV40早期mRNA poly(A)信号序列分析 | 第88-90页 |
| ·以Act-1基因核心启动子为转录元件重组表达载体的鉴定 | 第90-93页 |
| ·秀丽隐杆线虫组织特异性表达重组载体的鉴定 | 第93-94页 |
| ·核心启动子转录的EGFP基因在秀丽隐杆线虫体内中的表达 | 第94-96页 |
| ·具有roller表型的后代的获得 | 第94-95页 |
| ·转基因线虫后代的荧光观察 | 第95-96页 |
| ·核心启动子转录的EGFP基因在Vero细胞中的表达 | 第96-98页 |
| 3 讨论 | 第98-100页 |
| 第三章 捻转血矛线虫H11基因5’上游序列转录活性分析 | 第100-119页 |
| 摘要 | 第100页 |
| 1 材料与方法 | 第100-108页 |
| ·材料 | 第101页 |
| ·虫体 | 第101页 |
| ·菌株与质粒 | 第101页 |
| ·工具酶与试剂 | 第101页 |
| ·主要仪器设备 | 第101页 |
| ·溶液配制 | 第101页 |
| ·捻转血矛线虫基因组DNA的提取 | 第101页 |
| ·H11基因5’上游区域分析 | 第101-104页 |
| ·用于扩增H11基因5’上游部分基因组序列的引物设计 | 第102页 |
| ·利用基因步移技术扩增H11基因5’上游部分基因组序列 | 第102-104页 |
| ·H11基因5’上游部分基因组序列分析 | 第104页 |
| ·H11基因5’侧翼区启动子基序分析 | 第104页 |
| ·重组表达载体的构建策略 | 第104-105页 |
| ·H11基因5’侧翼区重组表达载体的构建 | 第105-106页 |
| ·H11基因5’侧翼区的PCR扩增 | 第105-106页 |
| ·H11基因5’侧翼区表达载体的构建 | 第106页 |
| ·携带有GFP基因的重组表达载体在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 | 第106-108页 |
| ·显微注射前所需器材的准备 | 第106页 |
| ·秀丽隐杆线虫显微注射用虫体的传代培养 | 第106页 |
| ·携带GFP基因的重组表达质粒的制备 | 第106页 |
| ·携带GFP基因的重组表达质粒的显微注射 | 第106-107页 |
| ·具有roller表型的转基因虫体的单虫PCR鉴定 | 第107页 |
| ·具有roller表型的转基因虫体的基因组整合试验 | 第107页 |
| ·具有roller表型转基因虫体的RT-PCR鉴定 | 第107-108页 |
| 2 结果 | 第108-116页 |
| ·利用基因步移技术获得基因组片段及其鉴定 | 第108-109页 |
| ·序列分析 | 第109-111页 |
| ·启动子元件分析 | 第111页 |
| ·重组表达载体HcHPS-pPD95.77和HcHPL-pPD95.77的鉴定 | 第111-113页 |
| ·转基因线虫后代的荧光观察 | 第113-114页 |
| ·HcHPL-pPD95.77注射的转基因虫体的PCR和RT-PCR鉴定 | 第114-116页 |
| 3 讨论 | 第116-119页 |
| 第四章 利用秀丽隐杆线虫表达H11蛋白的启动子筛选 | 第119-134页 |
| 摘要 | 第119-120页 |
| 1 材料与方法 | 第120-122页 |
| ·材料 | 第120-121页 |
| ·秀丽隐杆线虫 | 第120页 |
| ·菌株与质粒 | 第120页 |
| ·工具酶与试剂 | 第120页 |
| ·主要仪器设备 | 第120页 |
| ·溶液配制 | 第120-121页 |
| ·秀丽隐杆线虫基因组DNA的提取 | 第121页 |
| ·引物设计 | 第121页 |
| ·5’UTR的克隆 | 第121-122页 |
| ·构建策略 | 第122页 |
| ·5 ’-flanking region::GFP表达载体的构建 | 第122页 |
| ·携带有GFP基因的重组表达载体在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 | 第122页 |
| 2 结果 | 第122-132页 |
| ·基因5’侧翼区序列PCR产物的鉴定 | 第122页 |
| ·基因5’侧翼区序列主要启动子基序分析 | 第122-127页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第127页 |
| ·转基因线虫后代的荧光观察 | 第127-132页 |
| 3 讨论 | 第132-134页 |
| 第五章 H11蛋白的转基因表达研究 | 第134-155页 |
| 摘要 | 第134页 |
| 1 材料与方法 | 第134-144页 |
| ·材料 | 第135-136页 |
| ·秀丽隐杆线虫 | 第135页 |
| ·菌株与质粒 | 第135页 |
| ·工具酶与试剂 | 第135页 |
| ·主要仪器设备 | 第135页 |
| ·溶液配制 | 第135-136页 |
| ·捻转血矛线虫H11蛋白多克隆抗体的制备 | 第136-138页 |
| ·捻转血矛线虫H11基因完整cDNA序列及部分基因片段HPS(H11 PartialSequence)的PCR扩增 | 第136页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第136-137页 |
| ·IPTG诱导的重组蛋白表达与检测 | 第137页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第137-138页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第138页 |
| ·利用秀丽隐杆线虫转基因表达H11的策略 | 第138页 |
| ·cpr-1 5’-flanking region::GFP重组表达载体的改造 | 第138-141页 |
| ·去掉cpr-1 5’-flanking region::GFP重组载体GFP基因的引物设计 | 第138-139页 |
| ·cpr-pPD95.77(G-)载体的获得 | 第139-141页 |
| ·EGFP基因验证 | 第141页 |
| ·利用秀丽隐杆线虫表达H11基因 | 第141-142页 |
| ·H11基因的扩增与重组表达载体cpr-H11-ppd(G-)的构建 | 第141-142页 |
| ·显微注射 | 第142页 |
| ·单虫PCR鉴定 | 第142页 |
| ·具有roller表型的转基因虫体的基因组整合试验 | 第142页 |
| ·RT-PCR鉴定 | 第142页 |
| ·利用秀丽隐杆线虫表达H11基因的部分片段(Transgenic H11 PartialSequence,Trans-HPS) | 第142-143页 |
| ·H11基因部分片段Trans-HPS的PCR扩增与表达载体cpr-Trans-HPS-ppd(G-)的构建 | 第142-143页 |
| ·显微注射 | 第143页 |
| ·单虫PCR鉴定 | 第143页 |
| ·具有roller表型的转基因虫体的基因组整合试验 | 第143页 |
| ·RT-PCR鉴定 | 第143页 |
| ·转基因蛋白的western-blot分析 | 第143页 |
| ·利用镍琼脂糖凝胶柱纯化转基因蛋白的尝试 | 第143页 |
| ·转基因秀丽隐杆线虫的保存 | 第143-144页 |
| 2 结果 | 第144-153页 |
| ·原核表达载体H11-pET32和HPS-pET28的鉴定 | 第144页 |
| ·原核表达蛋白的检测与分析结果 | 第144-145页 |
| ·多克隆抗体制备的结果分析 | 第145页 |
| ·重组表达载体的改造与鉴定 | 第145-148页 |
| ·重组载体cpr-EGFP-pPD95.77在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 | 第148页 |
| ·重组载体cpr-H11-pPD95.77和cpr-Trans-HPS-pPD95.77的鉴定 | 第148-150页 |
| ·携带有cpr-H11-pPD95.77重组质粒的转基因线虫的鉴定 | 第150页 |
| ·携带有cpr-Trans-HPS-pPD95.77重组质粒的转基因线虫的鉴定 | 第150-151页 |
| ·转基因蛋白的Western-Blot分析 | 第151-152页 |
| ·利用镍琼脂糖凝胶柱纯化转基因蛋白的尝试 | 第152-153页 |
| 3 讨论 | 第153-155页 |
| 第六章 转基因秀丽隐杆线虫全虫抗原的粗提及免疫保护性试验 | 第155-168页 |
| 摘要 | 第155页 |
| 1 材料与方法 | 第155-160页 |
| ·材料 | 第155-156页 |
| ·实验场地及试验动物 | 第156页 |
| ·捻转血矛线虫L3感染性幼虫的准备 | 第156页 |
| ·秀丽隐杆线虫 | 第156页 |
| ·工具酶与试剂 | 第156页 |
| ·主要仪器设备 | 第156页 |
| ·溶液配制 | 第156页 |
| ·Trans-HPS转基因线虫成虫全虫蛋白的准备 | 第156-157页 |
| ·Trans-HPS转基因线虫成虫的液体培养 | 第157页 |
| ·Trans-HPS转基因线虫成虫全虫蛋白的粗制备 | 第157页 |
| ·原核表达蛋白HPS的制备与纯化 | 第157页 |
| ·实验分组及免疫 | 第157-158页 |
| ·组别设计 | 第157-158页 |
| ·免疫及攻虫 | 第158页 |
| ·各免疫指标测定 | 第158-160页 |
| ·ELISA检测抗体水平 | 第158-159页 |
| ·外周血淋巴细胞转化试验(MTT法) | 第159页 |
| ·虫卵计数 | 第159页 |
| ·幼虫孵化率 | 第159-160页 |
| ·减虫率计数 | 第160页 |
| 2 结果 | 第160-166页 |
| ·ELISA检测外周血血清抗体结果 | 第160-161页 |
| ·外周血淋巴细胞增殖活性 | 第161-163页 |
| ·虫卵计数及减卵率测定结果 | 第163页 |
| ·幼虫孵化率测定结果 | 第163-164页 |
| ·减虫率测定结果 | 第164-166页 |
| 3 讨论 | 第166-168页 |
| 总结与展望 | 第168-171页 |
| 1 论文主要结论及创新点 | 第168-169页 |
| 2 研究展望 | 第169-171页 |
| 附录1 溶液配制 | 第171-175页 |
| 附录2 英文缩写注释 | 第175-176页 |
| 附录3 实验过程中涉及的主要引物序列 | 第176-178页 |
| 附录4 H11的基因组序列 | 第178-183页 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 | 第183-184页 |
| 参考文献 | 第184-203页 |
