| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-34页 |
| 1.1 微生物脂肪酶简介 | 第14-26页 |
| 1.1.1 微生物脂肪酶的来源 | 第14-17页 |
| 1.1.2 微生物脂肪酶结构及作用机理 | 第17-18页 |
| 1.1.3 微生物脂肪酶的分泌机制 | 第18-21页 |
| 1.1.4 微生物脂肪酶的应用 | 第21-26页 |
| 1.2 微生物基因组学 | 第26-28页 |
| 1.2.1 微生物基因组学发展历史 | 第26-27页 |
| 1.2.2 微生物基因组学研究现状 | 第27页 |
| 1.2.3 微生物基因组学应用 | 第27-28页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第28-33页 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统的一般特点 | 第28-29页 |
| 1.3.2 基因改造 | 第29-32页 |
| 1.3.3 多拷贝外源基因在毕赤酵母表达系统中的应用 | 第32-33页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第33-34页 |
| 第二章 产脂肪酶菌株的筛选及基因组扫描分析 | 第34-60页 |
| 2.1 前言 | 第34页 |
| 2.2 材料和方法 | 第34-39页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第34-35页 |
| 2.2.2 产脂肪酶菌株的筛选 | 第35-36页 |
| 2.2.3 产脂肪酶菌株的分子鉴定 | 第36页 |
| 2.2.4 脂肪酶酶活力测定 | 第36-37页 |
| 2.2.5 脂肪酶菌株基因组扫描 | 第37-38页 |
| 2.2.6 脂肪酶菌株基因组预测分析 | 第38-39页 |
| 2.3 结果与分析 | 第39-59页 |
| 2.3.1 产脂肪酶菌株HS-BTL2的筛选及鉴定 | 第39-42页 |
| 2.3.2 产脂肪酶菌株HS-BTL2和HS-L6基因组扫描分析 | 第42-46页 |
| 2.3.3 产脂肪酶菌株HS-L6和HS-BTL2的代谢通路与代谢网络模型分析 | 第46-59页 |
| 2.4 小结 | 第59-60页 |
| 第三章 嗜温性脂肪酶HS-btlm基因的合成与克隆表达 | 第60-89页 |
| 3.1 前言 | 第60页 |
| 3.2 材料与方法 | 第60-66页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第60-61页 |
| 3.2.2 密码子的优化与引物设计 | 第61页 |
| 3.2.3 优化基因的人工合成 | 第61-64页 |
| 3.2.4 人工合成基因的校正 | 第64页 |
| 3.2.5 目的基因表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 | 第64页 |
| 3.2.6 同尾酶法构建多拷贝重组表达质粒 | 第64-65页 |
| 3.2.7 重组脂肪酶活性测定及酶学性质鉴定 | 第65页 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测多拷贝目的基因mRNA转录水平 | 第65页 |
| 3.2.9 重组脂肪酶在毕赤酵母中的表达及分离纯化 | 第65-66页 |
| 3.3 实验结果 | 第66-83页 |
| 3.3.1 嗜温性脂肪酶btl密码子的优化设计及引物合成 | 第66-68页 |
| 3.3.2 嗜温性脂肪酶优化基因HS-btlm的合成及校正 | 第68-71页 |
| 3.3.3 重组嗜温性脂肪酶优化基因HS-btlm的克隆表达 | 第71-73页 |
| 3.3.4 重组酵母工程菌的筛选与高密度表达 | 第73-76页 |
| 3.3.5 嗜温性脂肪酶基因多拷贝载体的构建及表达 | 第76-80页 |
| 3.3.6 HS-btlm不同拷贝数mRNA水平的测定 | 第80-83页 |
| 3.3.7 脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中的的表达及纯化 | 第83页 |
| 3.4 分析与讨论 | 第83-86页 |
| 3.4.1 重组脂肪酶HS-BTLm的真核表达 | 第83-84页 |
| 3.4.2 多拷贝重组质粒构建及毕赤酵母表达 | 第84-86页 |
| 3.5 小结 | 第86-89页 |
| 第四章 嗜温性脂肪酶蛋白HS-BTLm的功能鉴定 | 第89-96页 |
| 4.1 前言 | 第89页 |
| 4.2 材料与方法 | 第89-90页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第89页 |
| 4.2.2 脂肪酶最适pH的确定 | 第89页 |
| 4.2.3 脂肪酶最适反应温度的确定 | 第89-90页 |
| 4.2.4 脂肪酶底物特异性的测定 | 第90页 |
| 4.2.5 有机溶剂及洗涤剂对重组脂肪酶稳定性的影响 | 第90页 |
| 4.2.6 金属离子鳌合剂对脂肪酶活力的影响 | 第90页 |
| 4.3 实验结果 | 第90-95页 |
| 4.3.1 重组脂肪酶的最适反应条件 | 第90-92页 |
| 4.3.2 重组脂肪酶的底物专一性 | 第92-93页 |
| 4.3.3 有机溶剂和金属离子等对重组脂肪酶活性的影响 | 第93-95页 |
| 4.4 分析与讨论 | 第95页 |
| 4.5 小结 | 第95-96页 |
| 第五章 重组铜绿假单胞菌脂肪酶的表达及折叠复性 | 第96-112页 |
| 5.1 前言 | 第96-97页 |
| 5.2 材料与方法 | 第97-100页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第97页 |
| 5.2.2 脂肪酶HS-lip6基因的克隆 | 第97-98页 |
| 5.2.3 lipA、lipB的基因克隆及鉴定 | 第98页 |
| 5.2.4 重组脂肪酶在E.coli中表达和分离纯化 | 第98-99页 |
| 5.2.5 脂肪酶折叠蛋白的分离和纯化 | 第99页 |
| 5.2.6 原核表达重组脂肪酶的体外折叠复性 | 第99页 |
| 5.2.7 重组酵母表达载体的构建、转化及阳性转化子的筛选 | 第99页 |
| 5.2.8 高产菌株的筛选及表达产物纯化 | 第99-100页 |
| 5.2.9 酵母表达重组脂肪酶的体外折叠复性 | 第100页 |
| 5.3 实验结果 | 第100-109页 |
| 5.3.1 脂肪酶基因HS- lip6的克隆表达与分析 | 第100页 |
| 5.3.2 重组表达质粒pET-HS-lip6的构建及原核表达 | 第100-102页 |
| 5.3.3 脂肪酶基因lipA和折叠蛋白基因lipB的克隆表达与纯化 | 第102-104页 |
| 5.3.4 重组脂肪酶LIPA的体外折叠复性 | 第104-107页 |
| 5.3.5 重组脂肪酶LIPA和脂肪酶折叠蛋白LIPB在酵母中的分泌表达 | 第107-109页 |
| 5.5 分析与讨论 | 第109-110页 |
| 5.6 小结 | 第110-112页 |
| 全文总结 | 第112-114页 |
| 参考文献 | 第114-130页 |
| 在校期间发表的论文、科研成果等 | 第130-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
