| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第10-11页 |
| 实验技术路线图 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-38页 |
| 1.1 胆盐激活酯酶的结构及生理生化特点 | 第12-16页 |
| 1.1.1 胆盐激活酯酶基因结构特点 | 第12-13页 |
| 1.1.2 胆盐激活酯酶蛋白结构特点 | 第13-14页 |
| 1.1.3 胆盐激活酯酶的糖基化修饰特点 | 第14-15页 |
| 1.1.4 胆盐激活酯酶的底物特异性 | 第15页 |
| 1.1.5 胆盐激活酯酶的胆盐依赖性及酶稳定性 | 第15-16页 |
| 1.2 肠道内的胆盐激活酯酶 | 第16-26页 |
| 1.2.1 肠道内的胆盐激活酯酶的来源 | 第16-17页 |
| 1.2.2 乳脂的结构特点及其消化吸收 | 第17-18页 |
| 1.2.3 奶中胆盐激活酯酶的促脂消化作用 | 第18-20页 |
| 1.2.4 胆盐激活酯酶的抗病菌作用 | 第20-24页 |
| 1.2.5 胆盐激活酯酶对肠道菌群的调节作用 | 第24-25页 |
| 1.2.6 胆盐激活酯酶在固有免疫调节方面的潜在作用 | 第25-26页 |
| 1.3 胆盐激活酯酶在其他组织中的表达及病理涉及 | 第26-32页 |
| 1.3.1 胆盐激活酯酶与脂代谢及粥样动脉硬化 | 第27页 |
| 1.3.2 胆盐激活酯酶在血小板中的表达与血栓的调节 | 第27-28页 |
| 1.3.3 胆盐激活酯酶与炎症 | 第28页 |
| 1.3.4 胆盐激活酯酶多态性与疾病 | 第28-32页 |
| 1.4 胆盐激活酯酶转基因表达、纯化及应用进展 | 第32-37页 |
| 1.4.1 人胆盐激活酯酶转基因研究进展 | 第32-33页 |
| 1.4.2 人胆盐激活酯酶纯化方法研究进展 | 第33-34页 |
| 1.4.3 重组胆盐激活酯酶产品临床试验进展 | 第34-37页 |
| 1.5 总结 | 第37-38页 |
| 第二章 材料与方法 | 第38-59页 |
| 2.1 实验材料 | 第38-42页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第38页 |
| 2.1.2 实验动物和细胞系 | 第38页 |
| 2.1.3 主要试剂与试剂盒 | 第38-39页 |
| 2.1.4 主要溶液 | 第39-41页 |
| 2.1.5 实验仪器及耗材 | 第41页 |
| 2.1.6 实验分析软件 | 第41-42页 |
| 2.2 实验方法 | 第42-59页 |
| 2.2.1 感受态的制备 | 第42页 |
| 2.2.2 质粒提取 | 第42-43页 |
| 2.2.3 BAC的提取 | 第43页 |
| 2.2.4 组织基因组提取 | 第43页 |
| 2.2.5 组织RNA提取 | 第43-44页 |
| 2.2.6 DNA片段的连接反应 | 第44-45页 |
| 2.2.7 常规的酶切体系 | 第45页 |
| 2.2.8 重组质粒Cracking的快速鉴定法 | 第45页 |
| 2.2.9 PCR反应条件及体系 | 第45-46页 |
| 2.2.10 RNA的反转录 | 第46页 |
| 2.2.11 实时定量PCR测定转基因拷贝数 | 第46-47页 |
| 2.2.12 Southern blot | 第47-49页 |
| 2.2.13 蛋白浓度测定 | 第49页 |
| 2.2.14 Western blot | 第49-50页 |
| 2.2.15 鼠奶采集及处理 | 第50-51页 |
| 2.2.16 转基因小鼠的制备 | 第51-52页 |
| 2.2.17 转基因克隆牛的制备 | 第52-53页 |
| 2.2.18 激素诱导泌乳及正常泌乳 | 第53页 |
| 2.2.19 肝素凝胶色谱 | 第53-54页 |
| 2.2.20 凝胶过滤色谱 | 第54页 |
| 2.2.21 高效液相色谱测定蛋白纯度 | 第54页 |
| 2.2.22 重组人胆盐激活酯酶理化性质分析 | 第54-55页 |
| 2.2.23 酶联免疫法测定BSSL含量 | 第55页 |
| 2.2.24 放射性标记法测定人胆盐激活酯酶活性 | 第55-56页 |
| 2.2.25 重组人胆盐激活酯酶胆盐依赖性分析 | 第56-57页 |
| 2.2.26 重组人胆盐激活酯酶热稳定性分析 | 第57页 |
| 2.2.27 重组人胆盐激活酯酶pH稳定性分析 | 第57页 |
| 2.2.28 重组人胆盐激活酯酶胰蛋白酶稳定性分析 | 第57-58页 |
| 2.2.29 重组人胆盐激活酯酶与小分子的互作分析 | 第58-59页 |
| 第三章 利用BAC载体在小鼠乳腺中表达人胆盐激活酯酶 | 第59-75页 |
| 3.1 人胆盐激活酯酶BAC表达载体的构建及鉴定 | 第59-64页 |
| 3.1.1 将筛选基因Neo插入到BSSL基因下游 | 第59-60页 |
| 3.1.2 利用打靶载体抓捕BSSL-Neo基因 | 第60-61页 |
| 3.1.3 利用打靶载体将BSSL-Neo基因替换掉hLF基因 | 第61-64页 |
| 3.2 转基因小鼠的制备 | 第64页 |
| 3.3 胆盐激活酯酶小鼠模型鉴定 | 第64-70页 |
| 3.3.1 pBAC-hLF-hBSSL-Neo转基因阳性小鼠PCR鉴定 | 第64-66页 |
| 3.3.2 pBAC-hLF-hBSSL-Neo转基因阳性小鼠Southern blot鉴定 | 第66页 |
| 3.3.3 pBAC-hLF-hBSSL-Neo转基因阳性小鼠拷贝数鉴定 | 第66-67页 |
| 3.3.4 pBAC-hLF-hBSSL-Neo转基因阳性小鼠的传代情况 | 第67-68页 |
| 3.3.5 RT-PCR鉴定转基因小鼠人BSSLmRNA表达 | 第68-69页 |
| 3.3.6 Western blot鉴定rhBSSL在转基因小鼠奶中的表达 | 第69-70页 |
| 3.4 重组人胆盐激活酯酶的定量检测与活性评价 | 第70-71页 |
| 3.5 重组人胆盐激活酯酶对幼鼠生长和脂代谢的影响 | 第71-73页 |
| 3.6 结果分析与讨论 | 第73-75页 |
| 第四章 利用BAC载体在牛乳腺中表达人胆盐激活酯酶 | 第75-96页 |
| 4.1 重组人胆盐激活酯酶转基因牛的制备 | 第75-76页 |
| 4.2 重组人胆盐激活酯酶转基因牛的鉴定 | 第76-79页 |
| 4.2.1 pBAC-hLF-hBSSL转基因牛的分子鉴定 | 第76-77页 |
| 4.2.2 转基因牛的血生化和血常规分析 | 第77-79页 |
| 4.2.3 转基因牛的传代情况 | 第79页 |
| 4.3 rhBSSL在转基因牛乳中的表达与纯化 | 第79-87页 |
| 4.3.1 rhBSSL转基因牛的催乳及泌乳 | 第79-80页 |
| 4.3.2 目的蛋白在转基因牛奶中的表达鉴定 | 第80-82页 |
| 4.3.3 从转基因牛乳中纯化rhBSSL | 第82-86页 |
| 4.3.4 重组人胆盐激活酯酶蛋白回收率分析 | 第86-87页 |
| 4.4 rhBSSL的理化性质分析 | 第87-94页 |
| 4.4.1 重组人胆盐激活酯酶分子量测定 | 第87-88页 |
| 4.4.2 重组人胆盐激活酯酶N端氨基酸分析 | 第88页 |
| 4.4.3 重组人胆盐激活酯酶等电点分析 | 第88-89页 |
| 4.4.4 重组人胆盐激活酯酶活性分析 | 第89页 |
| 4.4.5 重组人胆盐激活酯酶N-糖基化位点分析 | 第89-90页 |
| 4.4.6 rhBSSL的胆盐依赖性及稳定性分析 | 第90-93页 |
| 4.4.7 rhBSSL与小分子的互作研究 | 第93-94页 |
| 4.5 结果分析与讨论 | 第94-96页 |
| 第五章 结论 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-111页 |
| 附录 | 第111-133页 |
| 附录1. 人胆盐激活酯酶基因及氨基酸序列 | 第111-126页 |
| 附录2. 重组人胆盐激活酯酶N-端序列测试图谱 | 第126-129页 |
| 附录3. 天然人胆盐激活酯酶N-端序列测试图谱 | 第129-132页 |
| 附录4. 重组人胆盐激活酯酶氨基酸组成摩尔百分比 | 第132页 |
| 附录5. 天然人胆盐激活酯酶氨基酸组成摩尔百分比 | 第132-133页 |
| 致谢 | 第133-135页 |
| 个人简历 | 第135-136页 |
