中文摘要 | 第8-10页 |
ABSTRACT | 第10-11页 |
缩略语表 | 第12-15页 |
1 前言 | 第15-55页 |
1.1 细菌毒素-抗毒素系统的研究进展 | 第16-25页 |
1.1.1 毒素-抗毒素系统概况 | 第16-17页 |
1.1.2 毒素-抗毒素系统的分类 | 第17-18页 |
1.1.3 毒素-抗毒素系统中毒素蛋白的作用机制 | 第18-20页 |
1.1.3.1 不依赖于核糖体的mRNA干扰酶(以MazEF系统中MazF为例) | 第18-19页 |
1.1.3.2 依赖于核糖体的mRNA干扰酶(以RelBE系统中RelE为例) | 第19-20页 |
1.1.4 毒素-抗毒素系统的生理功能 | 第20-24页 |
1.1.4.1 胸腺嘧啶缺陷致死 | 第20-21页 |
1.1.4.2 不依赖DNA损伤的复制受阻 | 第21-22页 |
1.1.4.3 应答抗生素处理 | 第22页 |
1.1.4.4 氨基酸饥饿条件下的严紧反应 | 第22-23页 |
1.1.4.5 TA系统网络 | 第23页 |
1.1.4.6 多级自调控 | 第23-24页 |
1.1.5 结核分枝杆菌中的MazEF系统的研究进展 | 第24-25页 |
1.2 DNA拓扑异构酶 | 第25-37页 |
1.2.1 DNA拓扑异构酶的分类 | 第25-28页 |
1.2.2 DNA拓扑异构酶的作用机制 | 第28-32页 |
1.2.2.1 IA型DNA拓扑异构酶 | 第28-30页 |
1.2.2.2 IB型DNA拓扑异构酶 | 第30-31页 |
1.2.2.3 Ⅱ型拓扑异构酶 | 第31-32页 |
1.2.3 分枝杆菌中DNA拓扑异构酶Ⅰ的研究现状 | 第32-37页 |
1.2.3.1 分支杆菌DNA拓扑异构酶Ⅰ的结构 | 第32-34页 |
1.2.3.2 分支杆菌DNA拓扑异构酶Ⅰ的的识别序列及作用机制 | 第34-36页 |
1.2.3.3 拓扑异构酶作为化学疗法的靶标 | 第36-37页 |
1.3 DNA分配系统(par位点) | 第37-48页 |
1.3.1 原核生物DNA分离机制研究 | 第38-47页 |
1.3.1.1 WalkerA细胞支架P环ATPase (ParA)与DNA分离 | 第38-45页 |
1.3.1.2 类肌动蛋白丝和质粒分离 | 第45-46页 |
1.3.1.3 编码类微管蛋白/FtsZ同源体的par位点 | 第46-47页 |
1.3.2 分枝杆菌染色体分配蛋白的研究现状 | 第47-48页 |
1.4 3-甲基腺嘌呤DNA糖基转移酶(TAG) | 第48-54页 |
1.4.1 DNA损伤修复系统对结核杆菌生存的意义 | 第48-49页 |
1.4.2 分枝杆菌中DNA损伤修复系统的研究进展 | 第49-52页 |
1.4.2.1 核苷酸切除修复(NER) | 第50页 |
1.4.2.2 碱基切除修复(BER) | 第50-52页 |
1.4.3 起始碱基切除修复过程的DNA糖基转移酶的研究进展 | 第52-54页 |
1.5 研究目的和意义 | 第54-55页 |
2 材料与方法 | 第55-92页 |
2.1 实验材料 | 第55-73页 |
2.1.1 菌株和质粒 | 第55-62页 |
2.1.2 PCR引物和两个短肽 | 第62-66页 |
2.1.3 MtbTopA和Rv1495切割实验和EMSA实验用的寡核苷酸链 | 第66页 |
2.1.4 培养基、抗生素及培养温度 | 第66-67页 |
2.1.5 试剂 | 第67页 |
2.1.6 相关试剂的配方 | 第67-72页 |
2.1.7 实验仪器 | 第72-73页 |
2.2 实验方法 | 第73-92页 |
2.2.1 核酸操作方法 | 第73-76页 |
2.2.2 蛋白质的原核表达纯化 | 第76-78页 |
2.2.3 SDS-PAGE | 第78-79页 |
2.2.4 分枝杆菌相关基因的克隆、表达和纯化 | 第79-80页 |
2.2.5 抗血清的制备 | 第80页 |
2.2.6 细菌双杂交实验 | 第80-81页 |
2.2.7 Pull-down及Western blot实验 | 第81-82页 |
2.2.8 DNA松弛活性测定 | 第82-83页 |
2.2.9 ssDNA或ssRNA底物的同位素标记 | 第83页 |
2.2.10 凝胶迁移率阻滞实验(EMSA) | 第83-84页 |
2.2.11 MtbTopA寡核苷酸切割活性实验 | 第84页 |
2.2.12 Rv1495的RNA切割活性实验 | 第84页 |
2.2.13 Co-IP实验 | 第84-85页 |
2.2.14 生长曲线测定 | 第85-86页 |
2.2.15 pMindMsParA敲除载体的构建及双交换菌株的获得 | 第86-87页 |
2.2.16 Southern blot | 第87-89页 |
2.2.17 基于重叠延伸PCR法的定点诱变 | 第89页 |
2.2.18 扫描电镜观察(SEM) | 第89-90页 |
2.2.19 DAPI(4',6'-diamidino-2-phenylindole)染色 | 第90页 |
2.2.20 MsTAG-GFP和MsParA-DsRed2荧光融合双超表达菌株的构建及共定位观察 | 第90-91页 |
2.2.21 ATPase活性测定 | 第91-92页 |
3 结果与分析 | 第92-129页 |
第一部分: Rv1495与DNA拓扑异构酶Ⅰ之间的相互作用研究 | 第92-111页 |
3.1 Rv1495与MtbTopA存在物理上的相互作用 | 第92-94页 |
3.2 Rv1495抑制MtbTopA的松弛活性 | 第94-98页 |
3.3 Rv1495抑制MtbTopA的单链DNA切割活性 | 第98-100页 |
3.3.1 MtbTopA具有较强的ssDNA结合活性,而Rv1495无DNA结合活性 | 第98-99页 |
3.3.2 MtbTopA具有较强的ssDNA切割活性,且其切割活性明显受Rv1495抑制 | 第99-100页 |
3.4 MtbTopA通过其CTD抑制Rv1495的mRNA切割活性 | 第100-102页 |
3.4.1 全长MtbTopA抑制Rv1495的mRNA切割活性 | 第100-101页 |
3.4.2 细菌双杂交实验表明MtbTopA通过CTD与Rv1495相互作用 | 第101-102页 |
3.4.3 MtbTopA通过CTD抑制Rv1495的mRNA切割活性 | 第102页 |
3.5 Rv1495与M. smegmatis拓扑异构酶Ⅰ(MsmTopA)存在体内和体外的相互作用 | 第102-105页 |
3.5.1 细菌双杂交和pull-down实验表明Rv1495与MsmTopA存在体外的相互作用 | 第102-104页 |
3.5.2 Co-IP实验表明Rv1495与MsmTopA在体内也存在互作 | 第104-105页 |
3.6 从Rv1495中鉴定出一个具有抑制活性的小肽Rv1495-N(29-56) | 第105-107页 |
3.7 Rv1495-N(29-56)失去了mRNA切割活性,但保留有抑制MsmTopA和分枝杆菌生长的能力 | 第107-111页 |
第二部分: 分枝杆菌3-甲基腺嘌呤DNA糖基转移酶TAG(Ms5082)与染色体分配蛋白ParA(Ms6939)之间的相互作用研究 | 第111-129页 |
3.8 耻垢分枝杆菌parA基因的敲除 | 第111页 |
3.9 ParA缺失会抑制耻垢分枝杆菌生长并导致细胞延长 | 第111-114页 |
3.10 在耻垢分枝杆菌中,ParA与3-甲基腺嘌呤DNA糖基转移酶Ⅰ(TAG)存在物理互作 | 第114-117页 |
3.11 在DNA损伤压力下,超表达MsTAG会导致分枝杆菌生长受阻及细胞延长 | 第117页 |
3.12 MsTAG对分枝杆菌生长的影响不依赖于DNA糖基转移酶活性 | 第117-120页 |
3.13 MsParA与MsTAG共表达可以抵消MsTAG超表达菌株的生长缺陷 | 第120-123页 |
3.14 MsTAG抑制MsParA的ATPase活性 | 第123-125页 |
3.15 MsTAG与MsParA在耻垢分枝杆菌体内共定位 | 第125页 |
3.16 TAG和ParA之间的互作在耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌中是保守的 | 第125-129页 |
4 总结与讨论 | 第129-135页 |
4.1 总结 | 第129-130页 |
4.2 讨论 | 第130-135页 |
4.2.1 结核分枝杆菌MazF同系物Rv1495与其唯一的DNA拓扑异构酶Ⅰ之间的相互作用研究 | 第130-132页 |
4.2.2 分枝杆菌染色体分配蛋白ParA与3-甲基腺嘌呤DNA糖基转移酶TAG之间的相互作用研究 | 第132-135页 |
参考文献 | 第135-153页 |
致谢 | 第153-154页 |
附录 | 第154-155页 |
作者简介和在读期间发表论文目录 | 第154-155页 |