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结核分枝杆菌的细胞生长调控机制研究--Rv1495与DNA拓扑异构酶Ⅰ以及DNA糖基转移酶与ParA之间的相互作用

中文摘要第8-10页
ABSTRACT第10-11页
缩略语表第12-15页
1 前言第15-55页
    1.1 细菌毒素-抗毒素系统的研究进展第16-25页
        1.1.1 毒素-抗毒素系统概况第16-17页
        1.1.2 毒素-抗毒素系统的分类第17-18页
        1.1.3 毒素-抗毒素系统中毒素蛋白的作用机制第18-20页
            1.1.3.1 不依赖于核糖体的mRNA干扰酶(以MazEF系统中MazF为例)第18-19页
            1.1.3.2 依赖于核糖体的mRNA干扰酶(以RelBE系统中RelE为例)第19-20页
        1.1.4 毒素-抗毒素系统的生理功能第20-24页
            1.1.4.1 胸腺嘧啶缺陷致死第20-21页
            1.1.4.2 不依赖DNA损伤的复制受阻第21-22页
            1.1.4.3 应答抗生素处理第22页
            1.1.4.4 氨基酸饥饿条件下的严紧反应第22-23页
            1.1.4.5 TA系统网络第23页
            1.1.4.6 多级自调控第23-24页
        1.1.5 结核分枝杆菌中的MazEF系统的研究进展第24-25页
    1.2 DNA拓扑异构酶第25-37页
        1.2.1 DNA拓扑异构酶的分类第25-28页
        1.2.2 DNA拓扑异构酶的作用机制第28-32页
            1.2.2.1 IA型DNA拓扑异构酶第28-30页
            1.2.2.2 IB型DNA拓扑异构酶第30-31页
            1.2.2.3 Ⅱ型拓扑异构酶第31-32页
        1.2.3 分枝杆菌中DNA拓扑异构酶Ⅰ的研究现状第32-37页
            1.2.3.1 分支杆菌DNA拓扑异构酶Ⅰ的结构第32-34页
            1.2.3.2 分支杆菌DNA拓扑异构酶Ⅰ的的识别序列及作用机制第34-36页
            1.2.3.3 拓扑异构酶作为化学疗法的靶标第36-37页
    1.3 DNA分配系统(par位点)第37-48页
        1.3.1 原核生物DNA分离机制研究第38-47页
            1.3.1.1 WalkerA细胞支架P环ATPase (ParA)与DNA分离第38-45页
            1.3.1.2 类肌动蛋白丝和质粒分离第45-46页
            1.3.1.3 编码类微管蛋白/FtsZ同源体的par位点第46-47页
        1.3.2 分枝杆菌染色体分配蛋白的研究现状第47-48页
    1.4 3-甲基腺嘌呤DNA糖基转移酶(TAG)第48-54页
        1.4.1 DNA损伤修复系统对结核杆菌生存的意义第48-49页
        1.4.2 分枝杆菌中DNA损伤修复系统的研究进展第49-52页
            1.4.2.1 核苷酸切除修复(NER)第50页
            1.4.2.2 碱基切除修复(BER)第50-52页
        1.4.3 起始碱基切除修复过程的DNA糖基转移酶的研究进展第52-54页
    1.5 研究目的和意义第54-55页
2 材料与方法第55-92页
    2.1 实验材料第55-73页
        2.1.1 菌株和质粒第55-62页
        2.1.2 PCR引物和两个短肽第62-66页
        2.1.3 MtbTopA和Rv1495切割实验和EMSA实验用的寡核苷酸链第66页
        2.1.4 培养基、抗生素及培养温度第66-67页
        2.1.5 试剂第67页
        2.1.6 相关试剂的配方第67-72页
        2.1.7 实验仪器第72-73页
    2.2 实验方法第73-92页
        2.2.1 核酸操作方法第73-76页
        2.2.2 蛋白质的原核表达纯化第76-78页
        2.2.3 SDS-PAGE第78-79页
        2.2.4 分枝杆菌相关基因的克隆、表达和纯化第79-80页
        2.2.5 抗血清的制备第80页
        2.2.6 细菌双杂交实验第80-81页
        2.2.7 Pull-down及Western blot实验第81-82页
        2.2.8 DNA松弛活性测定第82-83页
        2.2.9 ssDNA或ssRNA底物的同位素标记第83页
        2.2.10 凝胶迁移率阻滞实验(EMSA)第83-84页
        2.2.11 MtbTopA寡核苷酸切割活性实验第84页
        2.2.12 Rv1495的RNA切割活性实验第84页
        2.2.13 Co-IP实验第84-85页
        2.2.14 生长曲线测定第85-86页
        2.2.15 pMindMsParA敲除载体的构建及双交换菌株的获得第86-87页
        2.2.16 Southern blot第87-89页
        2.2.17 基于重叠延伸PCR法的定点诱变第89页
        2.2.18 扫描电镜观察(SEM)第89-90页
        2.2.19 DAPI(4',6'-diamidino-2-phenylindole)染色第90页
        2.2.20 MsTAG-GFP和MsParA-DsRed2荧光融合双超表达菌株的构建及共定位观察第90-91页
        2.2.21 ATPase活性测定第91-92页
3 结果与分析第92-129页
    第一部分: Rv1495与DNA拓扑异构酶Ⅰ之间的相互作用研究第92-111页
        3.1 Rv1495与MtbTopA存在物理上的相互作用第92-94页
        3.2 Rv1495抑制MtbTopA的松弛活性第94-98页
        3.3 Rv1495抑制MtbTopA的单链DNA切割活性第98-100页
            3.3.1 MtbTopA具有较强的ssDNA结合活性,而Rv1495无DNA结合活性第98-99页
            3.3.2 MtbTopA具有较强的ssDNA切割活性,且其切割活性明显受Rv1495抑制第99-100页
        3.4 MtbTopA通过其CTD抑制Rv1495的mRNA切割活性第100-102页
            3.4.1 全长MtbTopA抑制Rv1495的mRNA切割活性第100-101页
            3.4.2 细菌双杂交实验表明MtbTopA通过CTD与Rv1495相互作用第101-102页
            3.4.3 MtbTopA通过CTD抑制Rv1495的mRNA切割活性第102页
        3.5 Rv1495与M. smegmatis拓扑异构酶Ⅰ(MsmTopA)存在体内和体外的相互作用第102-105页
            3.5.1 细菌双杂交和pull-down实验表明Rv1495与MsmTopA存在体外的相互作用第102-104页
            3.5.2 Co-IP实验表明Rv1495与MsmTopA在体内也存在互作第104-105页
        3.6 从Rv1495中鉴定出一个具有抑制活性的小肽Rv1495-N(29-56)第105-107页
        3.7 Rv1495-N(29-56)失去了mRNA切割活性,但保留有抑制MsmTopA和分枝杆菌生长的能力第107-111页
    第二部分: 分枝杆菌3-甲基腺嘌呤DNA糖基转移酶TAG(Ms5082)与染色体分配蛋白ParA(Ms6939)之间的相互作用研究第111-129页
        3.8 耻垢分枝杆菌parA基因的敲除第111页
        3.9 ParA缺失会抑制耻垢分枝杆菌生长并导致细胞延长第111-114页
        3.10 在耻垢分枝杆菌中,ParA与3-甲基腺嘌呤DNA糖基转移酶Ⅰ(TAG)存在物理互作第114-117页
        3.11 在DNA损伤压力下,超表达MsTAG会导致分枝杆菌生长受阻及细胞延长第117页
        3.12 MsTAG对分枝杆菌生长的影响不依赖于DNA糖基转移酶活性第117-120页
        3.13 MsParA与MsTAG共表达可以抵消MsTAG超表达菌株的生长缺陷第120-123页
        3.14 MsTAG抑制MsParA的ATPase活性第123-125页
        3.15 MsTAG与MsParA在耻垢分枝杆菌体内共定位第125页
        3.16 TAG和ParA之间的互作在耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌中是保守的第125-129页
4 总结与讨论第129-135页
    4.1 总结第129-130页
    4.2 讨论第130-135页
        4.2.1 结核分枝杆菌MazF同系物Rv1495与其唯一的DNA拓扑异构酶Ⅰ之间的相互作用研究第130-132页
        4.2.2 分枝杆菌染色体分配蛋白ParA与3-甲基腺嘌呤DNA糖基转移酶TAG之间的相互作用研究第132-135页
参考文献第135-153页
致谢第153-154页
附录第154-155页
    作者简介和在读期间发表论文目录第154-155页

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