| 摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 1 前言 | 第15-24页 |
| ·RNA 依赖的RNA 聚合酶的命名及其分类 | 第15-16页 |
| ·RDRs 的分离鉴定 | 第16-17页 |
| ·RDRs 的结构特点 | 第17-18页 |
| ·RDRs 的诱导表达图谱 | 第18-19页 |
| ·生物胁迫诱导因子 | 第18页 |
| ·非生物胁迫诱导因子 | 第18-19页 |
| ·RDRs 的生物学功能 | 第19-23页 |
| ·RDRs 在植物RNA 沉默中的作用 | 第19-21页 |
| ·RNA 沉默的定义及分类 | 第19页 |
| ·参与RNA 沉默的细胞组分 | 第19页 |
| ·RDRs 的作用机制 | 第19-21页 |
| ·RDR6 与植物生长发育调节 | 第21页 |
| ·RDRs 与DNA 甲基化 | 第21页 |
| ·RDRs 在沉默信号长距离传输中的作用 | 第21-22页 |
| ·RDRs 在植物抗病毒中的作用 | 第22-23页 |
| ·RDRs 的其它生物学功能 | 第23页 |
| ·本课题研究的目的及意义 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-46页 |
| ·实验材料 | 第24-27页 |
| ·植物材料 | 第24页 |
| ·植物材料培养与处理 | 第24页 |
| ·菌株与质粒 | 第24页 |
| ·酶与各种生化试剂 | 第24-25页 |
| ·PCR 引物 | 第25-27页 |
| ·实验方法 | 第27-46页 |
| ·植物总RNA 的提取及检测 | 第27-29页 |
| ·利用RNeasy Plant Mini Kit 提取总RNA | 第27-28页 |
| ·利用TRIZOL 试剂盒提取RNA | 第28页 |
| ·甲醛变性凝胶进行RNA 电泳 | 第28-29页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第29-30页 |
| ·cDNA 回收纯化 | 第30页 |
| ·cDNA 的5′加尾反应 | 第30-31页 |
| ·cDNA 全长序列的获得 | 第31-34页 |
| ·NgRDR6 中间片段的获得 | 第31页 |
| ·RACE 法获得5′端序列 | 第31-32页 |
| ·RACE 法获得3′端序列 | 第32-33页 |
| ·cDNA 全长序列的获得 | 第33-34页 |
| ·电泳目的片段的回收 | 第34页 |
| ·DNA 片段与克隆载体的连接 | 第34-35页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备 | 第35页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第35页 |
| ·质粒DNA 的提取 | 第35-38页 |
| ·碱法小量提取质粒DNA | 第35-36页 |
| ·大量提取质粒DNA | 第36-37页 |
| ·试剂盒质粒微量提取方案 | 第37-38页 |
| ·对重组质粒的酶切鉴定 | 第38-39页 |
| ·NgRDR6 全长基因组序列的获得 | 第39-40页 |
| ·CTAB 法提取烟草基因组总DNA | 第39页 |
| ·总DNA 提取产物的纯化 | 第39-40页 |
| ·NgRDR6 基因启动子的克隆 | 第40-42页 |
| ·NgRDR6 基因启动子的反向PCR 扩增 | 第40-42页 |
| ·上游启动子序列的分析 | 第42页 |
| ·半定量RT-PCR 分析 | 第42页 |
| ·总RNA 的提取 | 第42页 |
| ·琼脂糖甲醛变性胶电泳 | 第42页 |
| ·反转录cDNA 第一条链的合成 | 第42页 |
| ·半定量RT-PCR 检测 | 第42页 |
| ·植物表达载体的构建与转化 | 第42-46页 |
| ·植物正义表达载体的构建 | 第42-43页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| ·冻融法转化农杆菌 | 第44页 |
| ·农杆菌介导转化烟草 | 第44-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-66页 |
| ·心叶烟RDR6 基因的分离 | 第46-48页 |
| ·总RNA 的提取及反转录 | 第46页 |
| ·心叶烟RDR6 基因中间片段的获得 | 第46-47页 |
| ·NgRDR6 3′片段的分离 | 第47页 |
| ·NgRDR6 5′片段的分离 | 第47-48页 |
| ·NgRDR6 全长cDNA 序列的获得 | 第48页 |
| ·NgRDR6 基因序列分析 | 第48-56页 |
| ·NgRDR6 cDNA 全长序列分析 | 第48-53页 |
| ·NgRDR6 蛋白质序列分析 | 第53-56页 |
| ·NgRDR6 基因组序列的克隆及其结构分析 | 第56页 |
| ·NgRDR6 mRNA 水平的表达图谱分析 | 第56-58页 |
| ·NgRDR6 在非生物因素诱导下的表达情况 | 第57页 |
| ·NgRDR6 在生物因素诱导下的表达情况 | 第57-58页 |
| ·NgRDR6 转基因植株的获得及其功能分析 | 第58-62页 |
| ·表达载体的构建 | 第59页 |
| ·转基因植株的获得 | 第59-60页 |
| ·T0 代转基因植株的鉴定 | 第60页 |
| ·转基因植株的半定量RT-PCR 分析 | 第60-61页 |
| ·T1 代转基因植株的鉴定及转基因植株的功能分析 | 第61-62页 |
| ·T1 代转基因植株的PCR 鉴定 | 第61页 |
| ·NgRDR6 在植物抗病毒中的作用 | 第61-62页 |
| ·NgRDR6 启动子的克隆及其缺失分析 | 第62-65页 |
| ·NgRDR6 启动子的克隆及其序列分析 | 第62-64页 |
| ·NgRDR6 启动子的缺失表达载体的构建 | 第64-65页 |
| ·NgRDR6 启动子的缺失表达转基因拟南芥的获得 | 第65页 |
| ·下一步实验计划 | 第65-66页 |
| 4 讨论 | 第66-70页 |
| ·NgRDR6 基因的克隆及其序列分析 | 第66页 |
| ·NgRDR6 的表达特异性分析 | 第66-68页 |
| ·NgRDR6 基因启动子顺式作用元件预测及分析 | 第68页 |
| ·NgRDR6 T1 代转基因烟草的抗性分析 | 第68-70页 |
| 小结 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-81页 |
| 附录 | 第81-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第84页 |