| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4-5页 |
| 第1章 前言 | 第11-25页 |
| 1.1 烟草花叶病毒的研究现状 | 第11-12页 |
| 1.2 抗烟草花叶病毒天然活性物质的研究现状 | 第12-15页 |
| 1.2.1 核糖体失活蛋白 | 第13-14页 |
| 1.2.2 病程相关蛋白 | 第14页 |
| 1.2.3 抗病毒因子 | 第14-15页 |
| 1.3 Y3蛋白的研究现状 | 第15-16页 |
| 1.4 双分子荧光互补技术的发展 | 第16-18页 |
| 1.5 定点突变技术的研究现状 | 第18-22页 |
| 1.5.1 重叠延伸PCR法 | 第18-19页 |
| 1.5.2 大引物PCR法 | 第19-20页 |
| 1.5.3 全质粒的一步反向PCR突变方法 | 第20-22页 |
| 1.6 研究内容与意义 | 第22-25页 |
| 1.6.1 研究内容 | 第22-23页 |
| 1.6.2 技术路线 | 第23页 |
| 1.6.3 研究意义 | 第23-25页 |
| 第2章 蛋白Y3和TMV CP基因cDNA克隆及序列分析 | 第25-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-26页 |
| 2.1.1 菌种 | 第25页 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 | 第25-26页 |
| 2.1.3 生物信息软件及网络资源 | 第26页 |
| 2.1.4 主要试剂及试剂盒 | 第26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-32页 |
| 2.2.1 y3基因和TMV CP基因cDNA序列扩增用引物 | 第26-27页 |
| 2.2.2 毛头鬼伞总RNA提取 | 第27页 |
| 2.2.3 烟草总RNA的提取 | 第27页 |
| 2.2.4 毛头鬼伞总RNA和烟草花叶病毒总RNA中残余DNA的去除 | 第27页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| 2.2.5.1 大肠杆菌的活化与培养 | 第28页 |
| 2.2.5.2 感受态细胞的制备（CaCl2法） | 第28页 |
| 2.2.6 RT-PCR扩增蛋白y3基因和TMV CP基因cDNA序列 | 第28-30页 |
| 2.2.6.1 y3基因和TMV CP基因cDNA第一条链的合成 | 第28-29页 |
| 2.2.6.2 y3基因和TMV CP基因cDNA序列的PCR扩增 | 第29-30页 |
| 2.2.7 PCR扩增产物的电泳和纯化 | 第30页 |
| 2.2.8 y3基因和TMV CP基因cDNA片段尾端加A | 第30页 |
| 2.2.9 y3基因和TMV CP基因cDNA序列克隆载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.10 重组质粒转化 | 第31页 |
| 2.2.11 重组质粒DNA的菌液PCR鉴定 | 第31页 |
| 2.2.12 基因克隆产物的序列测定 | 第31页 |
| 2.2.13 y3基因和TMV CP基因cDNA序列的推测与分析 | 第31-32页 |
| 2.3 结果与分析 | 第32-37页 |
| 2.3.1 毛头鬼伞总RNA和感病烟草总RNA的提取 | 第32页 |
| 2.3.2 y3基因和TMV CP基因cDNA序列PCR扩增结果 | 第32-33页 |
| 2.3.3 重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.4 y3基因和TMV CP基因cDNA序列测序结果 | 第34页 |
| 2.3.5 序列同源性分析及氨基酸比对 | 第34-37页 |
| 2.4 讨论和小结 | 第37-38页 |
| 第3章 双分子荧光互补载体的构建 | 第38-48页 |
| 3.1 实验材料 | 第38-39页 |
| 3.1.1 实验菌种和载体 | 第38-39页 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 | 第39页 |
| 3.1.3 生物信息软件及网络资源 | 第39页 |
| 3.1.4 主要试剂及试剂盒 | 第39页 |
| 3.2 实验方法 | 第39-43页 |
| 3.2.1 质粒pSPYNE(R)173、pSPYCE(M)的转化和提取 | 第39-40页 |
| 3.2.1.1 质粒pSPYNE(R)173、pSPYCE(M)的转化 | 第39页 |
| 3.2.1.2 质粒pSPYNE(R)173、pSPYCE(M)的提取 | 第39-40页 |
| 3.2.2 提取质粒pSPYNE(R)173、pSPYCE(M)的电泳检测 | 第40页 |
| 3.2.3 y3基因cDNA序列与质粒pSPYNE(R)173 的双酶切 | 第40页 |
| 3.2.4 TMV CP基因cDNA序列与质粒pSPYCE(M)的双酶切 | 第40-41页 |
| 3.2.5 双酶切产物的纯化和酶连 | 第41页 |
| 3.2.5.1 重组质粒pSPYNE(R)173-y3构建 | 第41页 |
| 3.2.5.2 重组质粒pSPYCE(M)-CP构建 | 第41页 |
| 3.2.6 大肠杆菌感受态的制备和转化 | 第41页 |
| 3.2.7 重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第41-42页 |
| 3.2.8 重组BiFC质粒pSPYNE(R)173-y3及pSPYCE(M)-CP的双酶切验证 | 第42-43页 |
| 3.2.8.1 重组BiFC质粒pSPYNE(R)173-y3及pSPYCE(M)-CP的提取 | 第42页 |
| 3.2.8.2 双酶切验证 | 第42-43页 |
| 3.2.9 y3基因及TMV CP基因cDNA序列的测定和分析 | 第43页 |
| 3.3 结果与分析 | 第43-46页 |
| 3.3.1 质粒pSPYNE(R)173、pSPYCE(M)的提取 | 第43-44页 |
| 3.3.2 y3基因cDNA序列与质粒pSPYNE(R)173 的双酶切结果 | 第44页 |
| 3.3.3 TMV CP基因cDNA序列与质粒pSPYCE(M)的双酶切结果 | 第44-45页 |
| 3.3.4 重组BiFC质粒pSPYNE(R)173-y3及pSPYCE(M)-CP的鉴定 | 第45-46页 |
| 3.4 讨论与小结 | 第46-48页 |
| 第4章 双分子荧光互补技术验证Y3蛋白与TMV CP的相互作用 | 第48-57页 |
| 4.1 实验材料 | 第48-49页 |
| 4.1.1 菌株、植物材料和质粒 | 第48页 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 | 第48页 |
| 4.1.3 生物信息软件及网络资源 | 第48页 |
| 4.1.4 主要试剂及试剂盒 | 第48-49页 |
| 4.2 实验方法 | 第49-51页 |
| 4.2.1 普通烟草K326的准备 | 第49页 |
| 4.2.2 农杆菌GV3101感受态细胞的制备 | 第49页 |
| 4.2.3 重组BiFC质 粒pSPYNE(R)173-y3、pSPYCE(M)-CP ， 空载体pSPYNE(R)173、pSPYCE(M)和助表达质粒p19转化农杆菌GV3101感受态 | 第49-50页 |
| 4.2.4 重组BiFC质粒pSPYNE(R)173-y3和pSPYCE(M)-CP转化农杆菌GV3101的菌液PCR检测 | 第50页 |
| 4.2.5 转化后的农杆菌GV3101的菌悬液渗透注射烟草叶片中 | 第50-51页 |
| 4.2.6 激光共聚焦显微镜观察 | 第51页 |
| 4.3 结果与分析 | 第51-55页 |
| 4.3.1 普通烟草K326植株 | 第51-52页 |
| 4.3.2 重组BiFC质粒pSPYNE(R)173-y3和pSPYCE(M)-CP的菌液PCR验证 | 第52-53页 |
| 4.3.3 BiFC分析蛋白Y3与TMV CP之间的相互作用 | 第53-55页 |
| 4.4 讨论与小结 | 第55-57页 |
| 第5章 双分子荧光互补技术检测Y3蛋白突变体与TMV CP的相互作用 | 第57-68页 |
| 5.1 实验材料 | 第57页 |
| 5.1.1 实验菌种和载体 | 第57页 |
| 5.1.2 主要仪器与设备 | 第57页 |
| 5.1.3 生物信息软件及网络资源 | 第57页 |
| 5.1.4 主要试剂及试剂盒 | 第57页 |
| 5.2 实验方法 | 第57-61页 |
| 5.2.1 引物设计、分析与合成 | 第57-58页 |
| 5.2.2 PCR扩增 | 第58页 |
| 5.2.3 突变目的基因的鉴定 | 第58页 |
| 5.2.4 PCR扩增产物的纯化 | 第58-59页 |
| 5.2.5 DpnI酶处理突变产物 | 第59页 |
| 5.2.6 DpnI酶处理突变产物的纯化 | 第59页 |
| 5.2.7 突变质粒的转化 | 第59页 |
| 5.2.8 突变重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第59-60页 |
| 5.2.9 定点突变重组子y3基因cDNA序列的测定和分析 | 第60页 |
| 5.2.10 重组BiFC突变质粒pSPYNE(R)173-y3转化农杆菌GV3101感受态 | 第60页 |
| 5.2.11 重组BiFC突变质粒pSPYNE(R)173-y3转化农杆菌GV3101的菌液PCR检测 | 第60页 |
| 5.2.12 转化后的农杆菌GV3101的菌悬液渗透注射烟草叶片中 | 第60-61页 |
| 5.2.13 激光共聚焦显微镜观察 | 第61页 |
| 5.3 结果与分析 | 第61-66页 |
| 5.3.1 定点突变重组子的构建 | 第61-62页 |
| 5.3.2 重组BiFC质粒pSPYNE(R)173-y3突变体的大肠杆菌菌液PCR验证 | 第62-63页 |
| 5.3.3 定点突变重组子序列的测定 | 第63页 |
| 5.3.4 定点突变重组BiFC质粒pSPYNE(R)173-y3转化农杆菌GV3101的菌液PCR验证 | 第63-64页 |
| 5.3.5 BiFC分析Y3蛋白突变体与TMV CP之间的相互作用 | 第64-66页 |
| 5.4 讨论与小结 | 第66-68页 |
| 第6章 结论与展望 | 第68-73页 |
| 6.1 结论 | 第68-71页 |
| 6.1.1 y3基因 与TMV CP基因cDNA序列的克隆和分析 | 第68页 |
| 6.1.2 重组双分子荧光互补载体pSPYNE(R)173-y3和pSPYCE(M)-CP的构建 | 第68-69页 |
| 6.1.3 Y3蛋白与TMV CP的体内互作检测 | 第69-70页 |
| 6.1.4 Y3蛋白突变体与TMV CP的体内互作检测 | 第70-71页 |
| 6.2 展望 | 第71-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-77页 |
