| 摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 1.文献综述 | 第14-26页 |
| 1.1 团头鲂简介 | 第14页 |
| 1.2 鱼类低氧应答相关研究进展 | 第14-19页 |
| 1.2.1 行为学和形态学研究 | 第14-15页 |
| 1.2.2 血液学和生理生化指标研究 | 第15-16页 |
| 1.2.3 免疫指标研究 | 第16页 |
| 1.2.4 抗氧化指标研究 | 第16-17页 |
| 1.2.5 基因表达相关研究 | 第17-19页 |
| 1.3 鱼类Phds家族简介 | 第19-21页 |
| 1.3.1 PHDs蛋白结构研究 | 第19-20页 |
| 1.3.2 PHDs蛋白功能研究 | 第20页 |
| 1.3.3 鱼类phds研究进展 | 第20-21页 |
| 1.4 PHDs启动子甲基化研究进展 | 第21-24页 |
| 1.4.1 DNA甲基化简介 | 第21-22页 |
| 1.4.2 DNA甲基化检测方法研究进展 | 第22-24页 |
| 1.4.3 PHDs甲基化与疾病关联性研究 | 第24页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第24-26页 |
| 2.材料与方法 | 第26-49页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-28页 |
| 2.1.1 实验用鱼 | 第26页 |
| 2.1.2 载体 | 第26页 |
| 2.1.3 细胞系 | 第26页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第26-27页 |
| 2.1.5 主要试剂 | 第27-28页 |
| 2.2 团头鲂低氧处理实验 | 第28-29页 |
| 2.3 团头鲂低氧耐受和敏感群体的筛选 | 第29页 |
| 2.4 团头鲂血液学、生理生化以及免疫学指标测定 | 第29-30页 |
| 2.5 Western blot分析 | 第30页 |
| 2.6 酚-氯仿法提取基因组DNA | 第30-31页 |
| 2.7 总RNA提取及cDNA合成 | 第31-32页 |
| 2.7.1 总RNA提取 | 第31-32页 |
| 2.7.2 cDNA合成 | 第32页 |
| 2.8 基于生物信息学和多重PCR技术扩增团头鲂phds全长和启动子 | 第32-38页 |
| 2.9 团头鲂phds生物信息学分析 | 第38-39页 |
| 2.10 荧光定量PCR和半定量PCR | 第39-40页 |
| 2.10.1 荧光定量PCR | 第39页 |
| 2.10.2 半定量PCR | 第39-40页 |
| 2.11 载体构建 | 第40-41页 |
| 2.11.1 融合表达载体的构建 | 第40页 |
| 2.11.2 双荧光素酶报告载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.12 细胞实验 | 第41-43页 |
| 2.12.1 细胞复苏 | 第41页 |
| 2.12.2 细胞传代 | 第41-42页 |
| 2.12.3 细胞转染 | 第42页 |
| 2.12.4 亚细胞定位和细胞增殖 | 第42页 |
| 2.12.5 双荧光素酶活性检测 | 第42-43页 |
| 2.13 基于TDN-PCR技术分析团头鲂phds启动子甲基化水平 | 第43-45页 |
| 2.13.1 基因组DNA硫化处理 | 第43-44页 |
| 2.13.2 Touch-down based nest-PCR（TDN-PCR）扩增硫化模板 | 第44页 |
| 2.13.3 HRM法分析团头鲂phds启动子的甲基化程度 | 第44-45页 |
| 2.13.4 TDN-PCR扩增其他鱼类phd1序列 | 第45页 |
| 2.14 数据分析 | 第45-49页 |
| 3.实验结果 | 第49-88页 |
| 3.1 低氧对团头鲂行为的影响 | 第49-51页 |
| 3.2 低氧对团头鲂生理生化和免疫指标的影响 | 第51-54页 |
| 3.2.1 低氧可显著诱导团头鲂血液学指标变化 | 第51-52页 |
| 3.2.2 低氧刺激团头鲂免疫应答活性 | 第52-53页 |
| 3.2.3 低氧诱导团头鲂组织特异性应答 | 第53-54页 |
| 3.3 基于生物信息学和多重PCR技术扩增phds cDNA和启动子 | 第54-61页 |
| 3.3.1 反转录用茎环结构引物与商业化试剂盒引物比较 | 第54-55页 |
| 3.3.2 反转录引物二级结构的比较 | 第55页 |
| 3.3.3 团头鲂phd1 cDNA和启动子扩增 | 第55-56页 |
| 3.3.4 团头鲂phd2 cDNA和启动子扩增 | 第56-57页 |
| 3.3.5 团头鲂phd3 cDNA和启动子扩增 | 第57-58页 |
| 3.3.6 该扩增方案在其他物种中的高效性验证 | 第58-61页 |
| 3.4 团头鲂phd1的功能分析 | 第61-67页 |
| 3.4.1 Phd1的序列特征 | 第61页 |
| 3.4.2 Phd1启动子cis-element预测 | 第61-62页 |
| 3.4.3 Phd1时空表达分析 | 第62-64页 |
| 3.4.4 Phd1在细胞中表达两个蛋白质 | 第64-65页 |
| 3.4.5 Phd1两个蛋白三维结构对比分析 | 第65-66页 |
| 3.4.6 Phd1蛋白定位于细胞核中 | 第66页 |
| 3.4.7 较大Phd1蛋白促进细胞增殖 | 第66-67页 |
| 3.5 团头鲂phd2的功能分析 | 第67-70页 |
| 3.5.1 Phd2的序列特征 | 第67-68页 |
| 3.5.2 Phd2启动子cis-element预测 | 第68-69页 |
| 3.5.3 Phd2时空表达分析 | 第69-70页 |
| 3.6 团头鲂phd3的功能分析 | 第70-75页 |
| 3.6.1 Phd3的序列特征 | 第70页 |
| 3.6.2 Phd3启动子cis-element预测 | 第70-71页 |
| 3.6.3 Phd3的时空表达分析 | 第71-72页 |
| 3.6.4 Phd3启动子中HRE对HIF-1α 产生应答 | 第72-73页 |
| 3.6.5 Phd3存在两个选择性剪接体 | 第73页 |
| 3.6.6 Phd3两个蛋白三维结构对比分析 | 第73-75页 |
| 3.7 团头鲂phds启动子甲基化水平分析 | 第75-81页 |
| 3.7.1 TDN-PCR比普通PCR具有更高特异性 | 第75-76页 |
| 3.7.2 TDN-PCR比普通PCR具有更高灵敏性 | 第76-77页 |
| 3.7.3 Phds在团头鲂低氧敏感和耐受个体中的表达分析 | 第77-78页 |
| 3.7.4 TDN-PCR扩增团头鲂phds启动子 | 第78-79页 |
| 3.7.5 团头鲂phds启动子甲基化程度分析 | 第79-81页 |
| 3.8 团头鲂phd1启动子甲基化水平分析 | 第81-83页 |
| 3.8.1 HRM分析团头鲂群体中phd1启动子甲基化的条件摸索 | 第81-82页 |
| 3.8.2 HRM标准曲线的构建结果 | 第82-83页 |
| 3.8.3 团头鲂phd1启动子甲基化程度与低氧敏感程度正相关 | 第83页 |
| 3.9 其他鱼类phd1启动子甲基化水平分析 | 第83-88页 |
| 3.9.1 其他鱼类phd1启动子和exon1扩增 | 第83-84页 |
| 3.9.2 TDN-PCR扩增不同鱼的phd1启动子 | 第84-86页 |
| 3.9.3 甲基化程度分析和统计 | 第86页 |
| 3.9.4 鱼类phd1甲基化程度与窒息点正相关 | 第86-88页 |
| 4.讨论 | 第88-104页 |
| 4.1 实验中的技术性问题 | 第88-92页 |
| 4.1.1 基于生物信息学和PCR技术扩增团头鲂phds的优势分析 | 第88-91页 |
| 4.1.2 基于TDN-PCR的甲基化研究优势分析 | 第91-92页 |
| 4.2 团头鲂低氧应激后的适应性分析 | 第92-97页 |
| 4.3 Phd1参与低氧应答机制分析 | 第97-100页 |
| 4.4 Phd2参与低氧应答机制分析 | 第100-101页 |
| 4.5 Phd3参与低氧应答机制分析 | 第101-102页 |
| 4.6 后续工作设想 | 第102-103页 |
| 4.7 本研究创新点 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-121页 |
| 附录 | 第121-123页 |
| 致谢 | 第123-124页 |
