| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-20页 |
| 1 淀粉酶 | 第11页 |
| 1.1 淀粉酶的来源及发展 | 第11页 |
| 1.2 淀粉酶的分类 | 第11页 |
| 2 α-淀粉酶 | 第11-14页 |
| 2.1 α-淀粉酶的简介 | 第11-12页 |
| 2.2 α-淀粉酶的催化机制 | 第12-13页 |
| 2.3 pH对α-淀粉酶的影响 | 第13页 |
| 2.4 α-淀粉酶的应用 | 第13-14页 |
| 3 常见α-淀粉酶的结构及功能 | 第14-15页 |
| 4 海洋新型α-淀粉酶AmyP | 第15-16页 |
| 5 α-淀粉酶AmyP的Domain B区域的特征 | 第16-18页 |
| 5.1 Domain B区域的确定 | 第16-17页 |
| 5.2 Domain B区域的二级结构预测 | 第17页 |
| 5.3 Domain B区域从序列分析上不存在结合Ca~(2+)的位点 | 第17-18页 |
| 6 本研究的目的和主要内容 | 第18-20页 |
| 6.1 研究目的 | 第18页 |
| 6.2 研究的主要内容 | 第18-20页 |
| 第二章 淀粉酶AmyP的Domain B区域缺失和单点突变体的克隆表达纯化 | 第20-31页 |
| 1 实验材料 | 第20-22页 |
| 1.1 试剂和仪器 | 第20-21页 |
| 1.1.1 菌株和载体 | 第20页 |
| 1.1.2 主要试剂和酶 | 第20-21页 |
| 1.1.3 实验仪器设备 | 第21页 |
| 1.2 培养基及试剂的配制 | 第21-22页 |
| 1.2.1 培养基的配制 | 第21页 |
| 1.2.2 试剂的配制 | 第21-22页 |
| 2 实验方法 | 第22-27页 |
| 2.1 化转感受态E.coli JM109和E.coli BL21(DE3)的制备方法 | 第22页 |
| 2.2 12%聚丙烯酰胺凝胶的配制 | 第22-23页 |
| 2.3 突变体的构建 | 第23-25页 |
| 2.3.1 AmyP-pUC18质粒的获得 | 第23页 |
| 2.3.2 Domain B区域突变体引物设计 | 第23页 |
| 2.3.3 突变体目的片段扩增 | 第23页 |
| 2.3.4 目的片段回收 | 第23-24页 |
| 2.3.5 目的片段的磷酸化及连接 | 第24页 |
| 2.3.6 目的片段的化学法转化 | 第24页 |
| 2.3.7 菌落PCR法验证阳性转化子 | 第24-25页 |
| 2.3.8 目标片段与表达载体的连接 | 第25页 |
| 2.4 突变体蛋白的表达和纯化 | 第25-27页 |
| 2.4.1 突变体蛋白的表达优化 | 第25-26页 |
| 2.4.2 突变体蛋白的纯化 | 第26-27页 |
| 3 结果 | 第27-30页 |
| 3.1 表达突变体的构建 | 第27-29页 |
| 3.2 突变体的表达纯化 | 第29-30页 |
| 4 小结 | 第30-31页 |
| 第三章 突变体的酶学性质和酶学动力学的研究 | 第31-42页 |
| 1 实验材料 | 第31-32页 |
| 1.1 实验试剂和仪器 | 第31-32页 |
| 1.1.1 实验试剂 | 第31页 |
| 1.1.2 实验仪器 | 第31-32页 |
| 1.2 实验试剂的配制 | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-35页 |
| 2.1 绘制葡萄糖标准曲线 | 第32-33页 |
| 2.2 绘制蛋白标准曲线(Bradford法) | 第33页 |
| 2.3 突变体酶学性质的测定 | 第33-35页 |
| 2.3.1 突变体酶活力的测定方法 | 第34页 |
| 2.3.2 突变蛋白工作浓度的测定方法 | 第34页 |
| 2.3.3 突变蛋白对可溶性糖的影响 | 第34页 |
| 2.3.4 突变蛋白对生淀粉的影响 | 第34-35页 |
| 2.4 突变体酶学动力学的测定 | 第35页 |
| 3 结果 | 第35-41页 |
| 3.1 突变体的酶学性质 | 第35-39页 |
| 3.1.1 Domain B区域缺失对酶活的影响 | 第35-36页 |
| 3.1.2 Domain B区域单点突变体对酶活的影响 | 第36-39页 |
| 3.2 突变体的酶学动力学 | 第39-41页 |
| 4 小结 | 第41-42页 |
| 第四章 影响酶反应速率下降因素的探索 | 第42-53页 |
| 1 实验材料 | 第42页 |
| 1.1 试剂和仪器 | 第42页 |
| 1.1.1 菌株和载体 | 第42页 |
| 1.2 培养基及试剂的配制 | 第42页 |
| 1.2.1 培养基的配制 | 第42页 |
| 1.2.2 实验试剂的配制 | 第42页 |
| 2 实验方法 | 第42-44页 |
| 2.1 荧光光谱检测Domain B区域的氨基酸对AmyP整体结构的影响 | 第42-43页 |
| 2.1.1 9个突变位点同时突变的突变体构建 | 第43页 |
| 2.1.2 荧光光谱见检测方法 | 第43页 |
| 2.2 检测Domain B区域的氨基酸对酶的催化微环境(解离)的影响 | 第43-44页 |
| 2.2.1 野生型AmyP和16个突变体的最适pH的检测方法 | 第43-44页 |
| 2.2.2 野生型AmyP和16个突变体的电离常数的检测方法 | 第44页 |
| 3 结果 | 第44-52页 |
| 3.1 Domain B区域的氨基酸改变对AmyP整体结构的影响 | 第44-48页 |
| 3.1.1 9位点同时突变表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 3.1.2 多点突变体的表达纯化 | 第45-46页 |
| 3.1.3 多点突变蛋白对可溶性淀粉和大米生淀粉的影响 | 第46-47页 |
| 3.1.4 突变体对酶的整体结构的影响 | 第47-48页 |
| 3.2 Domain B区域的氨基酸改变对酶的催化微环境(解离)的影响 | 第48-52页 |
| 3.2.1 Domain B区域氨基酸的改变对酶的最适pH的影响 | 第48-49页 |
| 3.2.2 Domain B区域的氨基酸对酶的电离影响的确认 | 第49-52页 |
| 4 小结 | 第52-53页 |
| 结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-60页 |
| 附录 1 | 第60-62页 |
| 附录 2 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第64页 |
