| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-14页 |
| 1.1 生物固氮 | 第10页 |
| 1.2 固氮细菌的起源 | 第10-11页 |
| 1.3 联合固氮微生物的研究状况 | 第11页 |
| 1.4 克雷伯氏菌的研究现状 | 第11页 |
| 1.5 桉树造林的研究现状 | 第11-12页 |
| 1.6 研究目的及意义 | 第12-13页 |
| 1.7 实验流程 | 第13-14页 |
| 第二章 材料与方法 | 第14-42页 |
| 2 | 第14-26页 |
| 2.1 实验材料 | 第14-20页 |
| 2.1.1 实验菌株与质粒 | 第14-15页 |
| 2.1.2 引物 | 第15页 |
| 2.1.3 抗生素 | 第15-16页 |
| 2.1.4 分离和富集无氮培养基 | 第16页 |
| 2.1.5 培养大肠杆菌的LB培养基和LA培养基 | 第16-17页 |
| 2.1.6 培养化转所需SOC培养基 | 第17页 |
| 2.1.7 植物培养基 | 第17-18页 |
| 2.1.8 抗生素敏感试验的MH培养基 | 第18页 |
| 2.1.9 常用琼脂糖凝胶电泳与实验溶液 | 第18-20页 |
| 2.2 实验仪器及试剂 | 第20-21页 |
| 2.2.1 本研究中用到的主要实验仪器和设备 | 第20-21页 |
| 2.2.2 本研究中所用到的主要实验耗材 | 第21页 |
| 2.3 常规微生物的培养与保存 | 第21-22页 |
| 2.4 常规分子操作 | 第22-24页 |
| 2.4.1 细菌基因组DNA提取 | 第22-23页 |
| 2.4.2 质粒的提取 | 第23-24页 |
| 2.4.3 DNA的纯化 | 第24页 |
| 2.5 大肠杆菌感受态的制备和细胞化学的转化 | 第24-25页 |
| 2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的CaCl_2化学制备方法 | 第24-25页 |
| 2.5.2 细胞化学转化法 | 第25页 |
| 2.6 PCR反应 | 第25-26页 |
| 2.6.1 引物的设计 | 第25页 |
| 2.6.2 PCR模板的制备 | 第25-26页 |
| 3 固氮菌株的分离鉴定 | 第26-28页 |
| 3.1 样品采集及固氮菌分离 | 第26-27页 |
| 3.1.1 样品的采集 | 第26-27页 |
| 3.1.2 固氮菌的分离 | 第27页 |
| 3.2 固氮菌的鉴定 | 第27-28页 |
| 3.2.1 固氮菌的形态及生理生化特征测定 | 第27页 |
| 3.2.2 固氮菌对抗生素药敏试验 | 第27页 |
| 3.2.3 固氮菌的分子水平鉴定 | 第27-28页 |
| 3.2.4 Biolog微生物鉴定系统鉴定 | 第28页 |
| 4 突变体库的构建及验证 | 第28-35页 |
| 4.1 突变体库的构建及筛选 | 第28-29页 |
| 4.1.1 两亲结合实验 | 第28-29页 |
| 4.1.2 突变体库的验证 | 第29页 |
| 4.2 Southern杂交验证Tn5随机插入突变体 | 第29-32页 |
| 4.2.1 DNA探针制备及Southern杂交 | 第29-32页 |
| 4.2.2 杂交膜保存 | 第32页 |
| 4.3 定植于桉树根目标突变体的筛选 | 第32-33页 |
| 4.3.1 组培苗的培养 | 第32页 |
| 4.3.2 定植于桉树根突变体的筛选 | 第32-33页 |
| 4.4 转座子Tn5插入位点的定位 | 第33-34页 |
| 4.4.1 转座子Tn5插入突变体基因的酶切 | 第33页 |
| 4.4.2 酶切DNA的自连 | 第33-34页 |
| 4.5 KO108和突变体MA、MD的生理生化检测 | 第34-35页 |
| 4.5.1 生长曲线的测定 | 第34页 |
| 4.5.2 菌膜的检测 | 第34页 |
| 4.5.3 游动性的检测 | 第34-35页 |
| 4.5.4 Biolog ECO对微生物碳源利用检测 | 第35页 |
| 5 KO108基因组文库的构建及验证 | 第35-39页 |
| 5.1 KO108基因组文库的构建 | 第35页 |
| 5.2 KO108基因组文库的构建所用载体及菌株特性 | 第35页 |
| 5.3 基因组文库的构建方法及验证 | 第35-39页 |
| 5.3.1 Cosmid质粒基因组文库构建步骤 | 第35-39页 |
| 5.3.2 基因组文库质量检测 | 第39页 |
| 6 基因组文库中NADP(H)基因DNA片段的克隆 | 第39-42页 |
| 6.1 菌落原位杂交筛选基因组文库中NADP(H)基因 | 第39-40页 |
| 6.1.1 随机引物标记法 | 第39页 |
| 6.1.2 杂交膜制备 | 第39-40页 |
| 6.2 NADP(H)基因的亚克隆 | 第40-42页 |
| 6.2.1 碱性磷酸酶的去磷酸反应 | 第40页 |
| 6.2.2 亚克隆 | 第40-42页 |
| 第三章 固氮菌株的筛选与鉴定结果分析 | 第42-46页 |
| 3.1 固氮菌株的筛选 | 第42页 |
| 3.2 固氮菌KO108的生理生化检测 | 第42-44页 |
| 3.3 固氮菌KO108的分子水平鉴定结果 | 第44-45页 |
| 3.4 Biolog微生物鉴定系统对固氮菌KO108的鉴定 | 第45-46页 |
| 第四章 突变体库构建及定植于桉树根的突变体Tn5插入位点的定位 | 第46-56页 |
| 4.1 突变体的筛选 | 第47-50页 |
| 4.1.1 突变体转座子Tn5插入序列分析 | 第48页 |
| 4.1.2 Southern杂交结果与分析 | 第48-50页 |
| 4.2 定植于桉树根突变株的筛选结果 | 第50-51页 |
| 4.3 MA和MD Tn5插入位点的定位 | 第51-52页 |
| 4.4 生长曲线的测定 | 第52-53页 |
| 4.5 菌膜的检测结果 | 第53页 |
| 4.6 游动性的检测结果 | 第53-54页 |
| 4.7 Biolog ECO对微生物碳源利用检测 | 第54-56页 |
| 第五章 KO108基因组文库的构建 | 第56-59页 |
| 5.1 细菌DNA的提取及优化 | 第56页 |
| 5.2 KO108基因文库的质量检测 | 第56-59页 |
| 第六章 NADP(H)基因及KO108有关趋化性基因的克隆 | 第59-63页 |
| 6.1 菌落原位杂交克隆编码NADP(H)的基因 | 第59-60页 |
| 6.2 趋化性基因的克隆 | 第60-63页 |
| 第七章 全文总结 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
