| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 缩略语表 | 第10-11页 |
| 1 引言 | 第11-18页 |
| 1.1 支原体概述 | 第11-12页 |
| 1.2 绵羊肺炎支原体的生物学特性 | 第12-13页 |
| 1.2.1 形态特性 | 第12页 |
| 1.2.2 培养特性 | 第12-13页 |
| 1.2.3 遗传特性 | 第13页 |
| 1.3 绵羊支原体性肺炎的流行概况 | 第13-14页 |
| 1.3.1 流行病学 | 第13-14页 |
| 1.3.2 临床症状 | 第14页 |
| 1.3.3 病理变化 | 第14页 |
| 1.4 致病机制 | 第14-15页 |
| 1.5 诊断方法 | 第15-17页 |
| 1.5.1 病原的分离培养 | 第15页 |
| 1.5.2 分子生物学检测 | 第15-16页 |
| 1.5.3 血清学检测 | 第16-17页 |
| 1.6 防治手段 | 第17页 |
| 1.7 本研究的目的及意义 | 第17-18页 |
| 2 绵羊肺炎支原体分离株p60、p65蛋白N端与C端的原核表达 | 第18-31页 |
| 2.1 试验材料 | 第18-19页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第18页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.4 主要溶液 | 第18-19页 |
| 2.2 试验方法 | 第19-24页 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 | 第19-20页 |
| 2.2.2 p60(N)、p60(C)、p65(N)和p65(C)基因扩增及点突变 | 第20-21页 |
| 2.2.3 PCR产物胶回收 | 第21页 |
| 2.2.4 重组克隆质粒的构建 | 第21-22页 |
| 2.2.5 重组质粒转化 | 第22页 |
| 2.2.6 重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第22页 |
| 2.2.7 阳性重组质粒的提取 | 第22-23页 |
| 2.2.8 重组质粒的双酶切鉴定 | 第23页 |
| 2.2.9 阳性菌液的测序、保存 | 第23页 |
| 2.2.10 重组质粒转化到表达宿主菌 | 第23页 |
| 2.2.11 融合蛋白的表达及最佳IPTG诱导浓度的确定 | 第23页 |
| 2.2.12 融合蛋白最佳诱导时间的确定 | 第23-24页 |
| 2.2.13 重组蛋白可溶性分析 | 第24页 |
| 2.2.14 重组蛋白的纯化 | 第24页 |
| 2.2.15 重组蛋白的Western blot分析 | 第24页 |
| 2.3 结果 | 第24-29页 |
| 2.3.1 p60-N、p60-C、p65-N和p65-C基因扩增、定点突变 | 第24-25页 |
| 2.3.2 重组表达载体的构建与鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.3 各融合蛋白最佳诱导表达条件的确定 | 第26-28页 |
| 2.3.4 各融合蛋白的Western blot分析 | 第28-29页 |
| 2.4 讨论 | 第29-30页 |
| 2.5 小结 | 第30-31页 |
| 3 p60-N、p60-C、p65-N、p65-C中优势抗原蛋白筛选及串联表达 | 第31-42页 |
| 3.1 试验材料 | 第31-32页 |
| 3.1.1 菌株及质粒 | 第31页 |
| 3.1.2 主要仪器设备 | 第31页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第31页 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 | 第31-32页 |
| 3.2 试验方法 | 第32-35页 |
| 3.2.1 蛋白浓度的测定 | 第32页 |
| 3.2.2 四种融合蛋白与MO全菌破碎蛋白ELISA结果比较 | 第32-33页 |
| 3.2.3 优势抗原蛋白串联重组表达 | 第33-35页 |
| 3.3 结果 | 第35-40页 |
| 3.3.1 蛋白浓度的测定结果 | 第35页 |
| 3.3.2 iELISA结果比较及优势抗原融合蛋白的筛选 | 第35-36页 |
| 3.3.3 抗原优势蛋白p60(N)-p65(C)串联基因的PCR扩增 | 第36页 |
| 3.3.4 重组表达载体p60(N)-p65(C)的构建与双酶切鉴定 | 第36-37页 |
| 3.3.5 p60(N)-p65(C)串联基因的测序比对结果 | 第37-39页 |
| 3.3.6 p60(N)-p65(C)融合蛋白的可溶性鉴定及纯化鉴定 | 第39页 |
| 3.3.7 p60(N)-p65(C)融合蛋白的Western blot分析 | 第39-40页 |
| 3.4 讨论 | 第40页 |
| 3.5 小结 | 第40-42页 |
| 4 p60(N)-p6(C)蛋白建立检测绵羊肺炎支原体的iELISA方法 | 第42-54页 |
| 4.1 试验材料 | 第42-43页 |
| 4.1.1 试验血清 | 第42页 |
| 4.1.2 试验主要仪器、设备 | 第42页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第42页 |
| 4.1.4 主要溶液的配制 | 第42-43页 |
| 4.2 试验方法 | 第43-45页 |
| 4.2.1 间接ELISA的基本操作方法 | 第43页 |
| 4.2.2 间接ELISA试验最佳工作条件的优化 | 第43-44页 |
| 4.2.3 间接ELISA阴、阳性临界值得确定 | 第44页 |
| 4.2.4 特异性试验 | 第44页 |
| 4.2.5 敏感性试验 | 第44-45页 |
| 4.2.6 重复性试验 | 第45页 |
| 4.2.7 两种iELISA方法检测血清结果比较 | 第45页 |
| 4.2.8 两种iELISA方法检测免疫血清的效价的比较 | 第45页 |
| 4.3 结果 | 第45-52页 |
| 4.3.1 最佳包被浓度以及一抗血清最佳稀释浓度的确定 | 第45-46页 |
| 4.3.2 抗原蛋白最佳包被条件的确定 | 第46-47页 |
| 4.3.3 一抗最佳孵育条件的确定 | 第47页 |
| 4.3.4 最佳封闭液的选择 | 第47-48页 |
| 4.3.5 最佳酶标二抗工作浓度的确定 | 第48页 |
| 4.3.6 间接ELISA阴、阳性临界值得确定 | 第48页 |
| 4.3.7 特异性试验 | 第48-49页 |
| 4.3.8 敏感性试验 | 第49页 |
| 4.3.9 重复性试验 | 第49页 |
| 4.3.10 两种iELISA方法检测临床血清样品的结果 | 第49-51页 |
| 4.3.11 两种iELISA方法检测免疫血清的效价的结果比较 | 第51-52页 |
| 4.4 讨论 | 第52-53页 |
| 4.5 小结 | 第53-54页 |
| 5 全文结论 | 第54-55页 |
| 致谢 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-61页 |
| 作者简介 | 第61页 |
