| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词 | 第7-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-26页 |
| 1.1 血友病概述 | 第12-18页 |
| 1.1.1 凝血机制的发展 | 第12-14页 |
| 1.1.2 血友病人的凝血机制 | 第14页 |
| 1.1.3 血友病的治疗 | 第14-16页 |
| 1.1.4 rFVII在临床中的应用 | 第16-17页 |
| 1.1.5 中国对凝血因子VII药物的需求 | 第17-18页 |
| 1.2 rFVII的重组表达及结构修饰 | 第18-21页 |
| 1.2.1 凝血因子七的结构 | 第18页 |
| 1.2.2 重组表达FVII的重组表达 | 第18-19页 |
| 1.2.3 rFVII的糖基化修饰和 γ 羧基化 | 第19-21页 |
| 1.3 rFVII仿制药研制需解决的问题 | 第21-24页 |
| 1.3.1 rFVII表达的瓶颈 | 第21-22页 |
| 1.3.2 传统高表达克隆筛选方法的缺陷 | 第22-23页 |
| 1.3.3 有效提高rFVII的表达水平 | 第23-24页 |
| 1.3.4 rFVII的高效分离纯化 | 第24页 |
| 1.4 立题依据及研究意义 | 第24-25页 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 | 第25-26页 |
| 第二章 rFVII表达CHO细胞的构建 | 第26-45页 |
| 2.1 前言 | 第26页 |
| 2.2 材料与方法 | 第26-32页 |
| 2.2.1 菌种、哺乳动物细胞及质粒 | 第26页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第26-27页 |
| 2.2.3 溶液和培养基的配制 | 第27-28页 |
| 2.2.4 共聚焦检测CHO/rFVII表达细胞 | 第28页 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测CHO/rFVII表达细胞 | 第28页 |
| 2.2.6 荧光抗体优化电转条件 | 第28-29页 |
| 2.2.7 G418筛选CHO细胞的检测 | 第29页 |
| 2.2.8 表达rFVII细胞的纯度 | 第29页 |
| 2.2.9 不同信号肽的rFVII表达质粒的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.10 rFVII表达细胞的建立与筛选 | 第30-31页 |
| 2.2.11 重组阳性克隆细胞的摇瓶培养 | 第31页 |
| 2.2.12 检测方法 | 第31-32页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第32-42页 |
| 2.3.1 共聚焦和流式细胞仪检测CHO/rFVII细胞 | 第32-33页 |
| 2.3.2 电压对转染效率的影响 | 第33-34页 |
| 2.3.3 质粒含量对转染效率的影响 | 第34-35页 |
| 2.3.4 电击次数对转染效率的影响 | 第35-36页 |
| 2.3.5 添加鲑鱼精DNA对转染效率的影响 | 第36-37页 |
| 2.3.6 G418筛选对转染细胞的影响 | 第37页 |
| 2.3.7 不同信号肽rFVII的表达质粒构建 | 第37-38页 |
| 2.3.8 不同信号肽rFVII表达细胞的建立及筛选 | 第38-40页 |
| 2.3.9 不同信号肽rFVII的CHO细胞株的批次培养 | 第40-42页 |
| 2.3.10 不同信号肽对fvii转录的影响 | 第42页 |
| 2.4 讨论 | 第42-43页 |
| 2.5 本章小结 | 第43-45页 |
| 第三章 rFVII高表达CHO克隆的高效筛选 | 第45-51页 |
| 3.1 前言 | 第45页 |
| 3.2 材料与方法 | 第45-46页 |
| 3.2.1 菌种、细胞和质粒 | 第45页 |
| 3.2.2 试剂及仪器 | 第45页 |
| 3.2.3 细胞分选 | 第45页 |
| 3.2.4 rFVII表达细胞纯度的检测 | 第45-46页 |
| 3.2.5 检测方法 | 第46页 |
| 3.3 结果 | 第46-50页 |
| 3.3.1 流式细胞仪分选条件对筛选克隆的影响 | 第46-47页 |
| 3.3.2 点杂交筛选高表达克隆 | 第47页 |
| 3.3.3 WB筛选高表达克隆 | 第47-48页 |
| 3.3.4 rFVII表达克隆的纯度检测 | 第48页 |
| 3.3.5 悬浮培养表达rFVII | 第48-49页 |
| 3.3.6 传代次数对工程细胞表达rFVII的影响 | 第49-50页 |
| 3.4 小结 | 第50-51页 |
| 第四章 CHO表达rFVII的培养条件优化 | 第51-63页 |
| 4.1 前言 | 第51页 |
| 4.2 材料与方法 | 第51-53页 |
| 4.2.1 哺乳动物细胞 | 第51-52页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第52页 |
| 4.2.3 接种密度和培养温度对CHO/rFVII培养的影响 | 第52页 |
| 4.2.4 基础和补料培养基对CHO/rFVII培养的影响 | 第52页 |
| 4.2.5 亚油酸和丁酸钠对CHO/rFVII培养的影响 | 第52-53页 |
| 4.2.6 细胞周期检测方法 | 第53页 |
| 4.2.7 生物反应器放大培养 | 第53页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第53-62页 |
| 4.3.1 接种密度对CHO/rFVII表达细胞培养的影响 | 第53-54页 |
| 4.3.2 培养温度对CHO/rFVII表达细胞培养的影响 | 第54-55页 |
| 4.3.3 无血清基础培养基对CHO/rFVII表达细胞培养的影响 | 第55-56页 |
| 4.3.4 无血清补料培养基对CHO/rFVII表达细胞培养的影响 | 第56-57页 |
| 4.3.5 无血清补料培养过程中CHO/rFVII表达细胞的细胞周期分析 | 第57-59页 |
| 4.3.6 亚油酸的添加对CHO/rFVII细胞生长和rFVII表达的影响 | 第59页 |
| 4.3.7 丁酸钠的添加对CHO/rFVII细胞生长和rFVII表达的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.8 亚油酸和丁酸钠的添加对细胞周期的影响 | 第60-61页 |
| 4.3.9 生物反应器培养并表达rFVII | 第61-62页 |
| 4.4 本章小结 | 第62-63页 |
| 第五章 rFVII的高效分离纯化 | 第63-73页 |
| 5.1 前言 | 第63页 |
| 5.2 材料与方法 | 第63-66页 |
| 5.2.1 菌种、CHO细胞与质粒 | 第63页 |
| 5.2.2 试剂和仪器 | 第63页 |
| 5.2.3 rFVII经Q离子交换柱富集 | 第63-64页 |
| 5.2.4 比较不同抗体制备的免疫亲和层析柱对rFVII纯化的影响 | 第64页 |
| 5.2.5 不同pH对r FVII纯化的影响 | 第64-65页 |
| 5.2.6 不同盐浓度对rFVII纯化的影响 | 第65页 |
| 5.2.7 稀释和浓缩培养基对rFVII纯化的影响 | 第65-66页 |
| 5.2.8 检测方法 | 第66页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第66-72页 |
| 5.3.1 离子交换柱浓缩富集rFVII | 第66-67页 |
| 5.3.2 不同抗体制备的纯化柱对rFVII纯化的影响 | 第67-68页 |
| 5.3.3 不同pH洗脱条件对r FVII纯化的影响 | 第68-69页 |
| 5.3.4 不同盐浓度洗脱条件对rFVII纯化的影响 | 第69-70页 |
| 5.3.5 稀释和浓缩培养基对rFVII纯化的影响 | 第70-71页 |
| 5.3.6 药物前体rFVII的生物活性 | 第71-72页 |
| 5.4 本章小结 | 第72-73页 |
| 主要结论与展望 | 第73-75页 |
| 主要结论 | 第73-74页 |
| 展望 | 第74-75页 |
| 论文主要创新点 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-82页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第82页 |
