| 中文摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-41页 |
| ·引言 | 第12-13页 |
| ·核黄素的概述 | 第13-26页 |
| ·核黄素的理化性质、功能、用途及市场需求 | 第13-14页 |
| ·核黄素的合成 | 第14-15页 |
| ·核黄素生物合成途径及其代谢调节机制 | 第15-22页 |
| ·产核黄素菌株构建的国内外现状 | 第22-26页 |
| ·β-胡萝卜素的概述 | 第26-35页 |
| ·β-胡萝卜素的理化性质、功能和用途 | 第27-29页 |
| ·β-胡萝卜素合成途径 | 第29-31页 |
| ·E.coli β-胡萝卜素生物合成研究进展 | 第31-35页 |
| ·大肠杆菌基因组无痕重组技术及策略 | 第35-36页 |
| ·λ-Red重组系统 | 第35-36页 |
| ·归巢核酸内切酶 | 第36页 |
| ·成簇间隔短回文重复(CRISPR)编辑系统 | 第36页 |
| ·选题背景及研究内容 | 第36-41页 |
| ·大肠杆菌核黄素产核黄素菌株的构建 | 第36-38页 |
| ·大肠杆菌产β-胡萝卜素的构建 | 第38-41页 |
| 第二章 核黄素操纵子的构建和比较 | 第41-70页 |
| ·实验材料 | 第41-46页 |
| ·菌株与质粒 | 第41-42页 |
| ·实验仪器 | 第42-43页 |
| ·实验试剂 | 第43-44页 |
| ·培养基 | 第44-45页 |
| ·溶液 | 第45-46页 |
| ·实验方法 | 第46-60页 |
| ·大肠杆菌CaCl_2转化法感受态细胞的制备与转化 | 第46-47页 |
| ·大肠杆菌电转化感受态的制备和电转化 | 第47-48页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第48页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第48-49页 |
| ·DNA片段的PCR扩增 | 第49-52页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第52-53页 |
| ·DNA片段的回收和纯化 | 第53-54页 |
| ·DNA片段的酶切和连接 | 第54-55页 |
| ·菌落PCR验证 | 第55-56页 |
| ·菌体培养与发酵 | 第56-57页 |
| ·发酵液菌体浓度和葡萄糖的测定 | 第57页 |
| ·发酵液中核黄素的测定 | 第57页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第57-58页 |
| ·细胞粗酶液的制备 | 第58-59页 |
| ·GTP环水解酶Ⅱ酶活力测定 | 第59页 |
| ·核黄素合成酶酶活力测定 | 第59-60页 |
| ·实验结果与讨论 | 第60-69页 |
| ·大肠杆菌自身核黄素合成途径的重构 | 第60-63页 |
| ·枯草芽孢杆菌核黄素操纵子的克隆 | 第63-65页 |
| ·枯草芽孢杆菌核黄素操纵子的重构 | 第65-67页 |
| ·系列工程菌株核黄素产量表征 | 第67-68页 |
| ·GTP环水解酶Ⅱ酶和核黄素合成酶活力测定 | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-70页 |
| 第三章 产核黄素大肠杆菌中心碳代谢途径的代谢工程改造 | 第70-93页 |
| ·实验材料 | 第71-72页 |
| ·菌种和质粒 | 第71-72页 |
| ·实验仪器 | 第72页 |
| ·实验试剂 | 第72页 |
| ·培养基 | 第72页 |
| ·溶液 | 第72页 |
| ·实验方法 | 第72-81页 |
| ·Circular polymerase extension cloning | 第72-74页 |
| ·6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶活力测定 | 第74页 |
| ·6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶酶活力测定 | 第74-75页 |
| ·Real-Time荧光定量PCR | 第75-78页 |
| ·发酵液中有机酸的检测 | 第78-79页 |
| ·大肠杆菌基于λ-red和Ⅰ-SceⅠ的基因重组 | 第79-81页 |
| ·实验结果与讨论 | 第81-92页 |
| ·谷氨酸棒状杆菌突变型zwf~(243)和gnd~(361)基因的过表达质粒构建 | 第81-82页 |
| ·氧化磷酸戊糖途径过表达质粒的构建 | 第82-83页 |
| ·pgi基因敲除菌株的构建 | 第83-85页 |
| ·ED途径敲除菌株的构建 | 第85-87页 |
| ·acs基因过表达菌株的构建 | 第87-89页 |
| ·氧化磷酸戊糖途径的改造对核黄素产量的影响 | 第89-90页 |
| ·pgi基因和ED途径的敲除对核黄素产量的影响 | 第90-91页 |
| ·acs基因的过表达对乙酸积累的影响 | 第91-92页 |
| ·本章小结 | 第92-93页 |
| 第四章 ribF基因的改造及发酵条件的优化 | 第93-105页 |
| ·实验材料 | 第93-94页 |
| ·菌种和质粒 | 第93-94页 |
| ·实验仪器 | 第94页 |
| ·实验试剂 | 第94页 |
| ·培养基 | 第94页 |
| ·溶液 | 第94页 |
| ·实验方法 | 第94-95页 |
| ·核黄素激酶酶活力测定 | 第94-95页 |
| ·实验结果与讨论 | 第95-104页 |
| ·ribF基因的改造 | 第95-96页 |
| ·置换ribF基因野生RBS片段的构建 | 第96-97页 |
| ·ribF基因野生RBS的置换 | 第97-98页 |
| ·ribF基因的改造对核黄素产量的影响 | 第98-99页 |
| ·发酵条件的优化 | 第99-104页 |
| ·本章小结 | 第104-105页 |
| 第五章 基于MEP途径的产β-胡萝卜素大肠杆菌构建 | 第105-123页 |
| ·实验材料 | 第105-107页 |
| ·菌种和质粒 | 第105-107页 |
| ·实验仪器 | 第107页 |
| ·实验试剂 | 第107页 |
| ·培养基 | 第107页 |
| ·溶液 | 第107页 |
| ·实验方法 | 第107-113页 |
| ·β-胡萝卜素的检测方法 | 第107-108页 |
| ·β-胡萝卜素的发酵实验 | 第108页 |
| ·基于CRISPR/Cas9系统λ-red重组 | 第108-111页 |
| ·Golded Gate组装方法 | 第111-112页 |
| ·gRNA质粒的构建 | 第112-113页 |
| ·实验结果与讨论 | 第113-122页 |
| ·整合β-胡萝卜素合成基因到大肠杆菌EcKan染色体上 | 第113-115页 |
| ·MEP途径调控元件的片段构建 | 第115-117页 |
| ·考察MEP途径单基因调控对β-胡萝卜素合成的影响 | 第117-119页 |
| ·MEP途径的组合优化 | 第119-122页 |
| ·本章小结 | 第122-123页 |
| 第六章 中心碳代谢及MEP途径的组合优化对β-胡萝卜素产量的影响 | 第123-143页 |
| ·实验材料 | 第124-127页 |
| ·菌种和质粒 | 第124-126页 |
| ·实验仪器 | 第126-127页 |
| ·实验试剂 | 第127页 |
| ·培养基 | 第127页 |
| ·溶液 | 第127页 |
| ·实验方法 | 第127-128页 |
| ·高密度发酵重组大肠杆菌ZF237T | 第127-128页 |
| ·实验结果与讨论 | 第128-142页 |
| ·中心碳代谢途径操作片段的构建 | 第128-130页 |
| ·考察中心碳代谢单基因调控对β-胡萝卜素合成的影响 | 第130-132页 |
| ·中心碳代谢组合操作对β-胡萝卜素合成的影响 | 第132-134页 |
| ·β-胡萝卜素合成途径及MEP途径的组合操作 | 第134-140页 |
| ·中心碳代谢及MEP途径的组合优化 | 第140-141页 |
| ·高密度发酵产β-胡萝卜素重组大肠杆菌ZF237T | 第141-142页 |
| ·本章小结 | 第142-143页 |
| 第七章 结论与展望 | 第143-147页 |
| ·结论及创新点 | 第143-145页 |
| ·主要结论 | 第143-145页 |
| ·创新点 | 第145页 |
| ·展望 | 第145-147页 |
| 参考文献 | 第147-166页 |
| 发表论文及参加科研情况说明 | 第166-168页 |
| 附录 | 第168-171页 |
| 致谢 | 第171-172页 |
