| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-37页 |
| ·丝状真菌宿主概述 | 第15-16页 |
| ·丝状真菌的遗传工程研究 | 第16-23页 |
| ·丝状真菌遗传转化方法 | 第16-17页 |
| ·功能基因组学研究方法 | 第17-20页 |
| ·限制性内切酶介导的整合(REMI) | 第17-18页 |
| ·转座子队列基因敲除(TAGKO) | 第18页 |
| ·RNA干扰技术(RNAi) | 第18-19页 |
| ·真菌分子遗传操作新技术 | 第19-20页 |
| ·丝状真菌高效基因操作的策略 | 第20-23页 |
| ·选择合适的筛选标记 | 第20-21页 |
| ·打靶载体的高效组装 | 第21-22页 |
| ·利用NHEJ缺陷型菌株作为转化宿主 | 第22页 |
| ·选择最适合的基因工程组合策略 | 第22-23页 |
| ·位点特异性重组在遗传操作中的应用 | 第23-29页 |
| ·主要的几种位点特异性重组系统 | 第24-27页 |
| ·基于λ噬菌体整合酶的Gateway重组系统 | 第24-25页 |
| ·应用最为广泛的Cre/loxP重组系统 | 第25-27页 |
| ·真核位点特异性重组系统的代表FLP/FRT | 第27页 |
| ·丝氨酸家族重组酶系统的β-rec/six | 第27页 |
| ·位点特异性重组系统的应用 | 第27-29页 |
| ·体外作为工具酶的应用 | 第27-28页 |
| ·基因打靶中筛选标记的回收 | 第28页 |
| ·多种重组酶的组合应用 | 第28-29页 |
| ·位点特异性重组系统存在的问题 | 第29页 |
| ·DNA双链断裂缺口的修复 | 第29-34页 |
| ·DNA双链缺口产生原因 | 第29页 |
| ·两种主要的修复途径HR和NHEJ | 第29-32页 |
| ·HR | 第30页 |
| ·NHEJ | 第30-32页 |
| ·Ku蛋白的研究 | 第32-33页 |
| ·Ku蛋白的结构特点 | 第32-33页 |
| ·Ku蛋白在NHEJ中发挥的作用 | 第33页 |
| ·Ku蛋白的其他功能 | 第33页 |
| ·丝状真菌NHEJ缺陷株对基因打靶效率的提高 | 第33-34页 |
| ·课题的主要研究内容 | 第34-37页 |
| ·课题背景 | 第34-36页 |
| ·主要研究思路与内容 | 第36-37页 |
| 第二章 里氏木霉高效可控型连续基因打靶工具的开发 | 第37-81页 |
| ·引言 | 第37页 |
| ·实验材料 | 第37-48页 |
| ·菌株与质粒 | 第37-40页 |
| ·扩增引物及相关lox位点的序列 | 第40-42页 |
| ·耗材与试剂 | 第42-43页 |
| ·仪器及设备 | 第43-44页 |
| ·培养基 | 第44-47页 |
| ·缓冲液及化学试剂配制 | 第47-48页 |
| ·实验方法 | 第48-58页 |
| ·质粒的抽提 | 第48页 |
| ·酶切反应 | 第48页 |
| ·PCR方法 | 第48-50页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第50页 |
| ·DNA片段胶回收 | 第50-51页 |
| ·PCR片段与克隆载体的的快速连接 | 第51页 |
| ·DNA片段与酶切载体的连接 | 第51页 |
| ·质粒构建一无缝克隆技术 | 第51-52页 |
| ·Trans1-T1感受态细胞的转化 | 第52页 |
| ·A.tumefaciens介导的结合转移 | 第52-54页 |
| ·A.tumefaciens GV3101感受态细胞的制备 | 第52-53页 |
| ·电转 | 第53-54页 |
| ·A.tumefaciens与T.reesei的结合转移 | 第54页 |
| ·T.reesei扩培,收集和保存孢子 | 第54-55页 |
| ·重组T.reesei转化株的筛选和验证 | 第55页 |
| ·T.reesei基因组抽提 | 第55页 |
| ·荧光定量PCR检测打靶载体拷贝数及相对转录水平 | 第55-57页 |
| ·T.reesei总RNA的提取 | 第55-56页 |
| ·cDNA的合成 | 第56页 |
| ·qPCR反应 | 第56-57页 |
| ·筛选标记的诱导缺失鉴定 | 第57-58页 |
| ·在不同碳源诱导下LML2.0a载体标记的缺失 | 第57页 |
| ·在木糖诱导下LML2.0和2.1系列载体的标记缺失 | 第57页 |
| ·在光诱导下LML3.0系列载体的标记缺失 | 第57-58页 |
| ·缺失过程的荧光蛋白检测 | 第58页 |
| ·紫外敏感度测试 | 第58页 |
| ·实验结果与讨论 | 第58-79页 |
| ·LML2.0f载体的构建 | 第58-59页 |
| ·LML2.0a-e系列载体的构建 | 第59-60页 |
| ·LML2.0-e的筛选标记缺失率统计 | 第60-63页 |
| ·木糖诱导LML2.0a-e筛选标记的缺失率统计 | 第60-61页 |
| ·不同碳源诱导下LML2.0a的缺失效率统计 | 第61-62页 |
| ·用红色荧光蛋白检测LML2.0a中加入z1序列的作用 | 第62-63页 |
| ·构建可视化的LML2.0s载体展示自切除的动态过程 | 第63-67页 |
| ·LML2.1系列载体的构建 | 第67-70页 |
| ·里氏木霉QM6aAtku70缺陷株的构建 | 第70-71页 |
| ·以QM6a△tku70为出发菌株的多基因敲除 | 第71-74页 |
| ·不同基因进行敲除时的同源重组率和筛选标记缺失效率 | 第71-73页 |
| ·LML2.12和LML2.11自切除后遗留位点的比较 | 第73-74页 |
| ·LML3.0光控系统的构建 | 第74-76页 |
| ·NHEJ途径可控的开关系统 | 第76-79页 |
| ·OFN1.0系列表达盒的构建策略 | 第76-77页 |
| ·ON/OFF状态下的tku70转录表达分析 | 第77-79页 |
| ·针对OFN1.0D开和关状态下菌株的紫外敏感度测试 | 第79页 |
| ·本章小结 | 第79-81页 |
| 第三章 里氏木霉DNA修复相关基因簇的鉴定 | 第81-112页 |
| ·引言 | 第81页 |
| ·实验材料 | 第81-86页 |
| ·菌株与质粒 | 第81-82页 |
| ·扩增引物 | 第82-84页 |
| ·耗材与试剂 | 第84页 |
| ·仪器和设备 | 第84页 |
| ·培养基 | 第84-85页 |
| ·缓冲液及化学试剂配制 | 第85-86页 |
| ·实验方法 | 第86-91页 |
| ·tre78582和tre108087基因序列的分析和进化树的构建 | 第86页 |
| ·光诱导转录水平分析 | 第86-87页 |
| ·光照培养分时段取样 | 第86页 |
| ·RNA的抽提和qRT-PCR检测转录水平 | 第86-87页 |
| ·里氏木霉△tku70,Atre78582,△tre108087,△tku70&tre108087敲除菌的构建 | 第87-88页 |
| ·里氏木霉△tre78582的分离和不同培养条件的表型差异 | 第88页 |
| ·△tre78582同核体单菌的分离验证 | 第88页 |
| ·不同培养条件下△tre78582的表型差异 | 第88页 |
| ·里氏木霉△tku70,△tre108087,△tku70&tre108087敲除菌对DNA损伤剂的敏感度测试 | 第88-89页 |
| ·回补和过表达菌株的构建 | 第89-90页 |
| ·△tre108087敲除菌的纤维素酶活测定 | 第90-91页 |
| ·葡萄糖标准曲线的绘制 | 第90页 |
| ·滤纸酶活FPA的测定 | 第90-91页 |
| ·实验结果与讨论 | 第91-109页 |
| ·三基因簇的鉴定和进化树分析 | 第91-95页 |
| ·tku70上游基因序列分析 | 第91-92页 |
| ·tku70下游基因序列分析 | 第92-93页 |
| ·三基因在基因组中的位置分布 | 第93-94页 |
| ·全真菌基因组范围寻找三基因的序列及位置特征 | 第94-95页 |
| ·光诱导基因转录水平分析 | 第95-97页 |
| ·光与基因表达的关联分析 | 第95页 |
| ·三基因受蓝光照射后转录水平差异分析 | 第95-96页 |
| ·三基因启动子序列中光控蛋白结合位点的分析 | 第96-97页 |
| ·里氏木霉亚铁螯合酶基因hem8的鉴定 | 第97-103页 |
| ·hem8基因敲除致死性 | 第97页 |
| ·hem8敲除菌异核体的获取 | 第97-99页 |
| ·hem8敲除菌同核体单菌的获取 | 第99-100页 |
| ·不同碳源和不同浓度血红素下hem8敲除菌的表型分析 | 第100-101页 |
| ·hem8基因的回补实验 | 第101-103页 |
| ·tku70和tre108087在DNA修复机制中的作用 | 第103-109页 |
| ·tre108087敲除菌纤维素酶活的变化 | 第103页 |
| ·对DNA损伤剂敏感度变化的分析 | 第103-105页 |
| ·tre108087基因的回补和过表达 | 第105-106页 |
| ·tre108087参与NHEJ途径的可能 | 第106-109页 |
| ·本章小结 | 第109-112页 |
| 第四章 总结与展望 | 第112-116页 |
| ·总结 | 第112-114页 |
| ·展望 | 第114-116页 |
| 参考文献 | 第116-125页 |
| 博士期间发表论文 | 第125-126页 |
| 致谢 | 第126页 |
