| 摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 缩略语 | 第16-18页 |
| 前言 | 第18-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-42页 |
| 第一节 TRAPP复合体 | 第20-23页 |
| 1 TRAPP复合体分类 | 第21-22页 |
| 2 展望 | 第22-23页 |
| 第二节 TRAPP复合体参与囊泡运输的功能研究 | 第23-32页 |
| 1 酵母细胞内的物质运输过程 | 第23-25页 |
| 2 TRAPP复合体参与囊泡运输的分子机制 | 第25-32页 |
| ·囊泡运输的四个重要步骤 | 第25-27页 |
| ·TRAPP复合体影响囊泡运输 | 第27-30页 |
| ·TRAPP复合体具有激活小G蛋白的功能 | 第30-32页 |
| 第三节 囊泡运输与细胞自噬 | 第32-40页 |
| 1 细胞自噬 | 第32-34页 |
| 2 自噬体的形成 | 第34-36页 |
| ·细胞自噬的运输过程 | 第34-35页 |
| ·Atg9参与自噬体膜的运输 | 第35页 |
| ·Atg8在自噬体形成中的作用 | 第35-36页 |
| 3 囊泡运输影响自噬体的形成 | 第36-38页 |
| 4 TRAPP参与细胞自噬 | 第38-40页 |
| 第四节 研究技术路线 | 第40-42页 |
| 1 TRAPP专一性亚基影响囊泡运输研究技术路线 | 第40页 |
| 2 TRAPP专一性亚基参与细胞自噬研究技术路线 | 第40-42页 |
| 第二章 TRAPP复合体专一性亚基Trs85对细胞内囊泡运输的影响及作用机制 | 第42-80页 |
| 摘要 | 第42-44页 |
| 第一节 酵母双杂交检测Trs85与其它TRAPP复合体亚基之间的互作 | 第44-49页 |
| 1 材料与方法 | 第44-45页 |
| ·实验材料 | 第44页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第44页 |
| ·载体构建及转化 | 第44-45页 |
| ·酵母双杂交检测蛋白互作 | 第45页 |
| 2 结果与分析 | 第45-48页 |
| ·Trs85与TRAPPⅠ复合体亚基互作 | 第46-47页 |
| ·Trs85不与TRAPPⅡ复合体亚基互作 | 第47-48页 |
| 3 小结 | 第48-49页 |
| 第二节 Trs85调控细胞内的v-SNARE蛋白Snc1离开内质网 | 第49-65页 |
| 1 材料与方法 | 第49-55页 |
| ·实验材料 | 第49页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第49-50页 |
| ·将GFP-SNC1、GFP-SNC1-PEM和HTB1-CFP质粒整合到酵母菌染色体上 | 第50页 |
| ·酵母交配和四分体分离 | 第50-51页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第51-52页 |
| ·扩增TRS85::KAN和TRS65::HYG的DNA片段 | 第52页 |
| ·敲除TRS85和TRS65基因 | 第52-53页 |
| ·生长表型检测 | 第53页 |
| ·细胞培养、细胞自噬诱导及荧光显微镜观察 | 第53-54页 |
| ·FM4-64染色定位内涵体或液泡 | 第54页 |
| ·DAPI染细胞核 | 第54-55页 |
| 2 结果与分析 | 第55-64页 |
| ·TRS85敲除引起GFP-Snc1标记菌株高温敏感 | 第56页 |
| ·trs85△ts突变体细胞内GFP-Snc1运输受阻于内部环状结构上 | 第56-58页 |
| ·GFP-Snc1积累在trs85△ts和yptlts突变体的内质网上 | 第58-61页 |
| ·GFP-Snc1积累在trs130ts和ypt31△/32ts突变体的内涵体上 | 第61页 |
| ·单向运输的GFP-Snc1-PEM积累在trs85△ts和yptlts的内质网上 | 第61-63页 |
| ·常温下Trs85缺失影响饥饿诱导的细胞自噬但不显著影响GFP-Snc1的运输 | 第63-64页 |
| 3 小结 | 第64-65页 |
| 第三节 Trs85通过小G蛋白Ypt1调控Snc1离开内质网 | 第65-76页 |
| 1 材料与方法 | 第65-67页 |
| ·实验材料 | 第65页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第65页 |
| ·载体构建及转化 | 第65-66页 |
| ·生长表型的检测 | 第66页 |
| ·Western Blot | 第66-67页 |
| ·细胞培养及荧光显微镜观察 | 第67页 |
| 2 结果与分析 | 第67-75页 |
| ·过量表达小G蛋白Yptl和Ypt31能分别恢复trs85I^ts和trsl30ts突变体对高温敏感的表型 | 第67-70页 |
| ·过量表达小G蛋白Yptl和Ypt31能分别恢复trs85Ats突变体和trsUOts突变体中GFP-Sncl积累的表型 | 第70页 |
| ·过量表达Trs85能部分恢复yptlts突变体高温敏感的表型,但不能恢复GFP-Sncl在细胞内的积累 | 第70-72页 |
| ·过量表达Trs130能部分恢复ypt31△/32ts突变体高温敏感及GFP-Snc1在细胞内积累的表型 | 第72-74页 |
| ·过量表达小G蛋白Ypt32能恢复trs130ts突变体对高温敏感和GFP-Snc1在细胞内积累的表型 | 第74页 |
| ·过量表达小G蛋白Ypt1不能恢复trs85△ts突变体中的细胞自噬缺陷表型 | 第74-75页 |
| 3 小结 | 第75-76页 |
| 第四节 本章讨论 | 第76-80页 |
| 1 Trs85参与内质网到高尔基体的囊泡运输 | 第76-77页 |
| 2 TRAPP复合体专一性亚基Trs85和Trs130分别通过对应的小G蛋白Ypt1和Ypt31/32调控囊泡运输 | 第77-80页 |
| 第三章 TRAPPⅡ复合体专一性亚基Trs130影响细胞自噬的研究 | 第80-138页 |
| 摘要 | 第80-82页 |
| 第一节 TRAPPⅡ专一性亚基Trs130参与细胞自噬 | 第82-99页 |
| 1 材料与方法 | 第82-89页 |
| ·实验材料 | 第82页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第82-83页 |
| ·敲除ATG1基因 | 第83-84页 |
| ·GFP-ATG8、RFP-APE1和ATG9-3XGFP质粒整合至酵母菌染色体 | 第84页 |
| ·细胞自噬的诱导与荧光观察 | 第84-85页 |
| ·Western blot检测细胞自噬蛋白降解 | 第85-86页 |
| ·酵母RNA的提取 | 第86-87页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第87-88页 |
| ·以TN124菌株为背景获得trs130ts菌株 | 第88页 |
| ·碱性磷酸酶活性测定 | 第88-89页 |
| ·TAKA分析(Transport of Atg9 after Knocking out ATG1) | 第89页 |
| 2 结果与分析 | 第89-98页 |
| ·Trs130影响细胞内prApe1的成熟 | 第90-91页 |
| ·Trs130影响细胞自噬过程中Atg8的降解 | 第91-93页 |
| ·trs130ts突变体中Pho8△60碱性磷酸酶活性水平下降 | 第93-95页 |
| ·GFP-Atg8在trs130ts突变体中形成多点状 | 第95-97页 |
| ·trs130ts突变体中Atg9从周围细胞器膜到PAS位点的顺向运输受阻 | 第97-98页 |
| 3 小结 | 第98-99页 |
| 第二节 Trs30影响部分Atg蛋白从高尔基体向PAS位点运输 | 第99-114页 |
| 1 材料与方法 | 第99-101页 |
| ·实验材料 | 第99页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第99页 |
| ·细胞自噬相关基因的敲除 | 第99-101页 |
| ·trs130ts vam3ts双突变体的构建 | 第101页 |
| ·细胞自噬的诱导与荧光观察 | 第101页 |
| ·Cu-Cherry-ATG8-415的诱导表达 | 第101页 |
| ·trs85△ trs130ts双突变体的获得 | 第101页 |
| ·Western blot检测细胞自噬 | 第101页 |
| 2 结果与分析 | 第101-113页 |
| ·trs130ts突变体中GFP-Atg8亮点不是自噬体 | 第101-104页 |
| ·trs130ts突变体中Atg8招募到PAS位点的过程受阻 | 第104-106页 |
| ·Trs130作用于Atg8-PE的运输 | 第106-108页 |
| ·在trsl30ts突变体中Atg8和Atg9部分积累在高尔基体上 | 第108-110页 |
| ·trs130ts突变体中Atg8与Atg9之间共定位率下降 | 第110-111页 |
| ·Trs130和Trs85在细胞自噬过程中作用于不同通路 | 第111-113页 |
| 3 小结 | 第113-114页 |
| 第三节 其它TRAPPⅡ专一性亚基不同程度影响细胞自噬 | 第114-125页 |
| 1 材料与方法 | 第114-116页 |
| ·实验材料 | 第114页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第114-115页 |
| ·trs33△ts和tca17△ts突变体的获得 | 第115-116页 |
| ·GFP-ATG8、RFP-APE1和ATG9-3XGFP的质粒整合 | 第116页 |
| ·细胞自噬的诱导与荧光观察 | 第116页 |
| ·Western blot检测细胞白噬 | 第116页 |
| ·以TN124菌株为背景获得trs65△ts菌株 | 第116页 |
| ·碱性磷酸酶活性测定 | 第116页 |
| ·TAKA分析 | 第116页 |
| 2 结果与分析 | 第116-124页 |
| ·trs65△ts与tca17△ts中细胞自噬过程受阻 | 第116-122页 |
| ·trs65△ts和tca17△ts突变体中GFP-Atg8形成多点状 | 第118页 |
| ·trs65△ts突变体中Pho8△60碱性磷酸酶活性下降 | 第118-119页 |
| ·trs65△ts突变体中Atg9循环的顺向运输受阻 | 第119-122页 |
| ·GFP-Atg8在trs33△ts突变体中形成多点状且降解受阻 | 第122页 |
| ·Trs120功能缺失致使GFP-Atg8形成多点状且降解受阻 | 第122-124页 |
| 3 小结 | 第124-125页 |
| 第四节 Trs130和Trs65通过小G蛋白Ypt31/32影响细胞自噬 | 第125-135页 |
| 1 材料与方法 | 第125-128页 |
| ·实验材料 | 第125页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第125-126页 |
| ·Ypt31Q和Ypt31S突变体的构建 | 第126-127页 |
| ·克隆YPT1和TCA17基因 | 第127页 |
| ·酵母菌中质粒转化 | 第127页 |
| ·细胞自噬的诱导与荧光观察 | 第127-128页 |
| ·Western blot检测细胞自噬 | 第128页 |
| ·碱性磷酸酶活性测定 | 第128页 |
| 2 结果与分析 | 第128-134页 |
| ·小G蛋白Ypt31恢复trs130ts突变体的细胞自噬缺陷表型 | 第128-131页 |
| ·小G蛋白Ypt31可以恢复trs65△ts突变体中的细胞自噬缺陷 | 第131页 |
| ·小G蛋白Ypt32可以恢复trs130ts突变体中的细胞自噬缺陷 | 第131-133页 |
| ·TRAPPⅡ复合体亚基Trs130、Trs65和Tca17不能恢复ypt31△/32ts突变体中的细胞自噬缺陷 | 第133-134页 |
| 3 小结 | 第134-135页 |
| 第五节 本章讨论 | 第135-138页 |
| 1. Trs130调控Atg8和Atg9从高尔基体向PAS位点的运输介导细胞自噬 | 第135-136页 |
| 2. 含有Trs130的TRAPPⅡ复合体激活小G蛋白Ypt31/32介导细胞自噬 | 第136页 |
| 3. Trs30所在的TRAPPⅡ与Trs85所在的TRAPPⅢ在细胞自噬中的关系 | 第136-138页 |
| 全文总结以及研究的创新之处 | 第138-140页 |
| 1 全文总结 | 第138-139页 |
| 2 创新之处 | 第139-140页 |
| 参考文献 | 第140-154页 |
| 附录一 本研究所用酵母菌株列表 | 第154-160页 |
| 附录二 本研究所用质粒列表 | 第160-161页 |
| 附录三 培养基、常备试剂与缓冲液 | 第161-166页 |
| 附录四 仪器设备清单 | 第166-168页 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 | 第168-170页 |
| 致谢 | 第170页 |
