| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 第1章 前言 | 第10-20页 |
| ·胸苷酸合成酶的简介 | 第10页 |
| ·TSase在肿瘤治疗中的应用 | 第10-11页 |
| ·脱氧胸苷酸合成酶抑制剂 | 第11-13页 |
| ·叶酸结构类似物 | 第11-12页 |
| ·非叶酸结构类似物 | 第12-13页 |
| ·TSase的催化机理 | 第13-14页 |
| ·微生物诱变选育 | 第14-18页 |
| ·诱变方法 | 第14-15页 |
| ·化学诱变 | 第14-15页 |
| ·物理诱变 | 第15页 |
| ·离子束注入技术 | 第15-18页 |
| ·离子注入的诱变机理 | 第15-16页 |
| ·离子注入微生物的生物学效应 | 第16-17页 |
| ·离子注入与传统辐射诱变效应的比较 | 第17-18页 |
| ·离子束诱变育种及介导转基因的研究 | 第18页 |
| ·本课题的研究目的、研究内容 | 第18-19页 |
| ·研究目的 | 第18页 |
| ·研究内容 | 第18-19页 |
| ·技术路线 | 第19-20页 |
| 第2章 大肠杆菌的离子注入诱变与胸腺嘧啶营养缺陷菌株的筛选 | 第20-31页 |
| ·前言 | 第20页 |
| ·材料与方法 | 第20-26页 |
| ·实验器材与材料 | 第20-22页 |
| ·低能氮离子束注入装置 | 第20页 |
| ·试剂与仪器 | 第20-22页 |
| ·生化试剂 | 第20-21页 |
| ·培养基的配制 | 第21页 |
| ·缓冲液的配制 | 第21-22页 |
| ·仪器 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-26页 |
| ·菌株培养 | 第22-23页 |
| ·大肠杆菌生长曲线的测定 | 第23页 |
| ·接种物的培养 | 第23页 |
| ·E.coli菌株生长曲线测定 | 第23页 |
| ·菌悬液的制备 | 第23页 |
| ·离子束注入诱变处理 | 第23页 |
| ·离子注入后处理 | 第23页 |
| ·突变菌株的筛选 | 第23-24页 |
| ·甲氧苄啶浓缩处理 | 第23-24页 |
| ·T~-营养缺陷型筛选 | 第24页 |
| ·T~-营养缺陷菌的稳定性研究 | 第24-25页 |
| ·离子束注入诱变育种流程 | 第25-26页 |
| ·结果与分析 | 第26-30页 |
| ·E.coli BL21菌株生长曲线测定 | 第26-27页 |
| ·N~+注入对菌体存活率的影响 | 第27-28页 |
| ·甲氧苄啶对突变菌筛选的影响 | 第28-30页 |
| ·谷氨酸钠(MSG)对甲氧苄啶筛选的影响 | 第28-30页 |
| ·小结 | 第30-31页 |
| 第3章 胸腺嘧啶营养缺陷菌的DNA碱基突变检测与分析 | 第31-47页 |
| ·前言 | 第31-32页 |
| ·实验材料与方法 | 第32-39页 |
| ·试剂与仪器设备 | 第32-35页 |
| ·化学试剂 | 第32页 |
| ·生物试剂 | 第32-33页 |
| ·培养基配方 | 第33页 |
| ·克隆用缓冲液 | 第33-34页 |
| ·菌种与质粒 | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34-35页 |
| ·方法 | 第35-39页 |
| ·菌体培养 | 第35页 |
| ·菌株保藏 | 第35页 |
| ·突变子基因组DNA的提取和检测 | 第35页 |
| ·PCR扩增ThyA基因 | 第35-36页 |
| ·ThyA基因PCR产物的回收 | 第36-37页 |
| ·ThyA基因与载体连接 | 第37页 |
| ·感受态细胞的制备(CaCl2法) | 第37页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第37-38页 |
| ·质粒DNA的制备(碱裂解法) | 第38页 |
| ·DNA双酶切反应 | 第38页 |
| ·重组子的筛选 | 第38-39页 |
| ·测序与突变位点分析 | 第39页 |
| ·ThyA核苷酸位点及其氨基酸位点标号 | 第39页 |
| ·结果与分析 | 第39-46页 |
| ·PCR扩增结果 | 第39-40页 |
| ·克隆载体构建 | 第40页 |
| ·测序与序列比对 | 第40-46页 |
| ·测序结果 | 第40-41页 |
| ·序列比对与结构分析 | 第41-46页 |
| ·T~-突变子NT0109 ThyA基因的blastn比对 | 第41-43页 |
| ·T~-突变子NT0109的blastx比对 | 第43-44页 |
| ·TSase蛋白三级结构分析 | 第44-46页 |
| ·小节 | 第46-47页 |
| 第4章 变异TSase蛋白的诱导表达及酶活的分析 | 第47-56页 |
| ·序言 | 第47页 |
| ·材料与方法 | 第47-51页 |
| ·材料 | 第47-49页 |
| ·菌株 | 第47页 |
| ·培养基成分及抗生素配制 | 第47-48页 |
| ·凝胶的配制 | 第48页 |
| ·载体 | 第48-49页 |
| ·方法 | 第49-51页 |
| ·酶切体系 | 第49页 |
| ·质粒的连接反应体系 | 第49页 |
| ·重组质粒pET-28a的转化 | 第49-50页 |
| ·大肠杆菌BL21感受态的制备 | 第50页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第50页 |
| ·转化子pET-28a-ThyA质粒的双酶切验证反应体系 | 第50页 |
| ·pET-28a-ThyA转化子突变TSase的诱导表达 | 第50页 |
| ·菌体的收集 | 第50页 |
| ·细胞总蛋白组分 | 第50页 |
| ·目的蛋白的SDS-PAGE分析 | 第50-51页 |
| ·酶活性的鉴定 | 第51页 |
| ·结果与分析 | 第51-55页 |
| ·表达载体的构建 | 第51-52页 |
| ·重组菌胸苷酸合成酶的表达 | 第52-53页 |
| ·胸苷酸合成酶活性的鉴定 | 第53-55页 |
| ·小结 | 第55-56页 |
| 第5章 结论与展望 | 第56-58页 |
| ·结论 | 第56页 |
| ·展望 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
