| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-11页 |
| 1.前言 | 第11-24页 |
| ·细胞色素P450 | 第11-14页 |
| ·细胞色素P450概述 | 第11-12页 |
| ·细胞色素P450的多样性 | 第12-14页 |
| ·细胞色素P450分布的多样性 | 第12页 |
| ·细胞色素P450结构的多样性 | 第12-13页 |
| ·细胞色素P450催化机理及其功能多样性 | 第13-14页 |
| ·细胞色素P450底物的广谱性 | 第14页 |
| ·真菌细胞色素P450 | 第14-16页 |
| ·CYP51——甾醇14α-去甲基化酶 | 第16-20页 |
| ·CYP51——甾醇14α-去甲基化酶概述 | 第16-20页 |
| ·CYP51基因调节 | 第16-17页 |
| ·CYP51活性 | 第17-19页 |
| ·CYP51结构 | 第19-20页 |
| ·CYP51抑制剂研究概况 | 第20-24页 |
| ·CYP51抑制剂作用机制 | 第20-21页 |
| ·CYP51基因与真菌对DMIs的抗性关系 | 第21-24页 |
| ·CYP51点突变导致真菌对DMIs产生抗性 | 第21-22页 |
| ·CYP51基因表达水平的改变 | 第22-24页 |
| 2.材料与方法 | 第24-33页 |
| ·实验材料 | 第24-26页 |
| ·菌株和质粒 | 第24页 |
| ·化学试剂及抗菌素 | 第24页 |
| ·常用贮存液 | 第24页 |
| ·工具酶与其它试剂 | 第24页 |
| ·培养基 | 第24-25页 |
| ·常用缓冲液 | 第25-26页 |
| ·杀菌剂 | 第26页 |
| ·实验方法 | 第26-33页 |
| ·真菌DNA的提取——CTAB法 | 第26页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51基因的特异性引物的设计 | 第26-27页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51基因的扩增 | 第27页 |
| ·DNA限制性内切酶消化 | 第27页 |
| ·DNA片段的回收和连接 | 第27-28页 |
| ·质粒DNA的提取——碱解法小提质粒 | 第28页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第28-29页 |
| ·α互补法筛选阳性克隆 | 第29页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第29页 |
| ·重组蛋白的原核表达 | 第29页 |
| ·重组目的蛋白的大量表达 | 第29-30页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第30页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51的生物信息学分析预测 | 第30-31页 |
| ·重组蛋白粗提纯和定量 | 第31页 |
| ·重组蛋白质中CYP51含量测定 | 第31页 |
| ·重组蛋白同小分子杀菌剂结合光谱的测定 | 第31-32页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞的制备和转化 | 第32页 |
| ·菌落PCR鉴定重组酿酒酵母重组子 | 第32-33页 |
| 3 结果及分析 | 第33-63页 |
| ·玉米黑粉菌DNA的提取 | 第33页 |
| ·PCR扩增玉米黑粉菌CYP51 | 第33-34页 |
| ·重组质粒pMD-YH的构建 | 第34-35页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51测序结果 | 第35-36页 |
| ·重组表达质粒pET-YH/pGEX-KG-YH的构建 | 第36-41页 |
| ·pET-YH表达质粒的构建 | 第36-39页 |
| ·pET28-YH表达质粒的构建 | 第36-38页 |
| ·pET32-YH表达质粒的构建 | 第38-39页 |
| ·pGEXKG-YH表达质粒的构建 | 第39-41页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51的表达及表达条件的优化 | 第41-44页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51在大肠杆菌中的表达 | 第41-42页 |
| ·IPTG诱导浓度和诱导表达温度的优化 | 第42-43页 |
| ·不同表达宿主菌的诱导表达 | 第43-44页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51的生物信息学分析预测 | 第44-47页 |
| ·CYP51跨膜结构分析 | 第44-45页 |
| ·CYP51全长及突变体同源模件构建 | 第45-47页 |
| ·CYP51突变体序列的克隆 | 第47页 |
| ·GYP51突变体序列的表达质粒的构建 | 第47-48页 |
| ·CYP51突变体序列测序结果 | 第48-51页 |
| ·CYP51突变体序列的原核表达 | 第51-53页 |
| ·CYP51突变体在大肠杆菌中表达 | 第51-52页 |
| ·GYP51突变体在大肠杆菌中的表达条件的优化 | 第52-53页 |
| ·重组CYP51突变体蛋白含量测定 | 第53-54页 |
| ·重组CYP51突变体蛋白和同小分子杀菌剂结合光谱的测定 | 第54-61页 |
| ·重组CYP51突变体蛋白和标准杀菌剂的结合光谱 | 第55-56页 |
| ·重组玉米黑粉菌CYP51蛋白和同XF系列合成杀菌剂的结合光谱 | 第56-61页 |
| ·CYP51酿酒酵母真核表达质粒的构建 | 第61页 |
| ·含有CYP51的酿酒酵母重组子鉴定 | 第61-63页 |
| 4 讨论 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-73页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
