| 摘要（中文） | 第1-8页 |
| 摘要（英文） | 第8-10页 |
| 1 引言 | 第10-31页 |
| 1．1 橡胶生产历史的简短回顾 | 第10-11页 |
| 1．2 橡胶树产胶生理学 | 第11-12页 |
| 1．3 橡胶树分子生物学研究现状 | 第12-16页 |
| 1．3．1 已克隆的重要功能基因 | 第13-14页 |
| 1．3．1．1 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因 | 第13页 |
| 1．3．1．2 橡胶延长因子（rubber elongation element, REF）基因 | 第13页 |
| 1．3．1．3 Hevein基因 | 第13-14页 |
| 1．3．1．4 法尼二磷酸合成酶（farnesyl diphosphat synthase, FDP）基因 | 第14页 |
| 1．3．2 乳管特异表达基因 | 第14-15页 |
| 1．3．3 橡胶树基因工程研究现状 | 第15-16页 |
| 1．4 植物启动子研究进展 | 第16-22页 |
| 1．4．1 植物启动子的结构特征 | 第16-18页 |
| 1．4．1．1 转录起始位点 | 第17页 |
| 1．4．1．2 TATA-box和CAAT-box | 第17页 |
| 1．4．1．3 G-box | 第17-18页 |
| 1．4．2 双向（bidirection）启动子和可变（alternative）启动子 | 第18页 |
| 1．4．3 环境响应启动子 | 第18-21页 |
| 1．4．3．1 ABA响应启动子 | 第18-19页 |
| 1．4．3．2 乙烯响应启动子 | 第19-20页 |
| 1．4．3．3 光响应启动子 | 第20页 |
| 1．4．3．4 真菌诱导表达启动子 | 第20页 |
| 1．4．3．5 植物防卫基因启动子 | 第20-21页 |
| 1．4．4 植物组织特异表达启动子 | 第21-22页 |
| 1．5 植物生物反应器表达外源蛋白 | 第22-28页 |
| 1．5．1 植物表达系统生产外源蛋白的优越性 | 第22-24页 |
| 1．5．2 影响植物生产外源蛋白主要因素 | 第24-26页 |
| 1．5．2．1 启动子和启动子活性 | 第24页 |
| 1．5．2．2 蛋白质稳定性 | 第24-25页 |
| 1．5．2．3 下游加工 | 第25-26页 |
| 1．5．3 植物生产外源蛋白的策略 | 第26-28页 |
| 1．5．3．1 外源蛋白的表达策略 | 第26页 |
| 1．5．3．2 稳定表达系统 | 第26-27页 |
| 1．5．3．3 植物病毒介导的外源蛋白表达 | 第27-28页 |
| 1．5．4 小结 | 第28页 |
| 1．6 橡胶树乳管系统——植物生物反应器的理想场所 | 第28-30页 |
| 1．7 本研究的技术路线 | 第30-31页 |
| 2 材料与方法 | 第31-54页 |
| 2．1 材料及试剂 | 第31页 |
| 2．1．1 植物材料 | 第31页 |
| 2．1．2 质粒及菌种 | 第31页 |
| 2．1．3 试剂 | 第31页 |
| 2．2 方法 | 第31-54页 |
| 2．2．1 橡胶树凝集因子（hevein）基因及橡胶树延伸因子（ref）基因的分离 | 第31-37页 |
| 2．2．1．1 橡胶胶乳总RNA的提取 | 第31-32页 |
| 2．2．1．2 引物设计与合成 | 第32页 |
| 2．2．1．3 cDNA第一链的合成 | 第32-33页 |
| 2．2．1．4 聚合酶链式反应（PCR）扩增hevein基因和ref基因 | 第33页 |
| 2．2．1．5 PCR产物的回收 | 第33-34页 |
| 2．2．1．6 PCR片段的连接与转化 | 第34-36页 |
| 2．2．1．7 DNA序列测定 | 第36-37页 |
| 2．2．2 橡胶树胶乳和叶片hevein基因及ref基因表达的Northern-blot分析 | 第37-40页 |
| 2．2．2．1 橡胶胶乳总RNA的提取 | 第37页 |
| 2．2．2．2 橡胶叶片总RNA的提取 | 第37页 |
| 2．2．2．3 探针的标记 | 第37-38页 |
| 2．2．2．4 电泳准备 | 第38页 |
| 2．2．2．5 RNA样品准备 | 第38页 |
| 2．2．2．6 电泳 | 第38页 |
| 2．2．2．7 转膜 | 第38-39页 |
| 2．2．2．8 预杂交及杂交 | 第39页 |
| 2．2．2．9 洗膜及显色 | 第39-40页 |
| 2．2．3 hevein基因、ref基因、hmgl基因5’端启动子序列的分离 | 第40-43页 |
| 2．2．3．1 橡胶树叶片基因组DNA的提取 | 第40页 |
| 2．2．3．2 构建Genome Walker文库 | 第40-41页 |
| 2．2．3．3 Genome Walker DNA Walking | 第41-43页 |
| 2．2．4 Hevein基因5’端启动子序列的系列缺失及嵌合植物表达载体的构建 | 第43-46页 |
| 2．2．4．1 PCR引物的设计 | 第43-44页 |
| 2．2．4．2 聚合酶链式反应（PCR）扩增hevein基因各启动子片段 | 第44-45页 |
| 2．2．4．3 PCR产物的回收 | 第45页 |
| 2．2．4．4 PCR产物的酶切 | 第45页 |
| 2．2．4．5 植物表达载体pBI121的酶切 | 第45-46页 |
| 2．2．4．6 PCR酶切产物与植物表达载体pBI121连接 | 第46页 |
| 2．2．5 ref基因5’端启动子序列取代35S启动子植物表达载体的构建 | 第46-48页 |
| 2．2．5．1 PCR引物的设计 | 第46-47页 |
| 2．2．5．2 聚合酶链式反应（PCR）扩增ref基因启动子 | 第47页 |
| 2．2．5．3 PCR产物的回收 | 第47页 |
| 2．2．5．4 PCR产物的酶切 | 第47页 |
| 2．2．5．5 植物表达载体pBI121的酶切 | 第47-48页 |
| 2．2．5．6 PCR酶切产物与植物表达载体pBI121连接 | 第48页 |
| 2．2．6 嵌合载体在橡胶树胶乳中瞬时表达的研究 | 第48-49页 |
| 2．2．6．1 质粒的大量提取和纯化 | 第48页 |
| 2．2．6．2 胶乳的准备及GUS基因的体外表达 | 第48-49页 |
| 2．2．6．3 ABA及乙烯利对嵌合质粒的诱导作用 | 第49页 |
| 2．2．7 基因枪转化橡胶瞬时表达的研究 | 第49-51页 |
| 2．2．7．1 外植体的准备 | 第49-50页 |
| 2．2．7．2 微弹的准备 | 第50页 |
| 2．2．7．3 基因枪转化 | 第50页 |
| 2．2．7．4 GUS基因组织化学检测 | 第50-51页 |
| 2．2．8 嵌合载体转化烟草的研究 | 第51-54页 |
| 2．2．8．1 培养基 | 第51页 |
| 2．2．8．2 无菌外植体的获得 | 第51页 |
| 2．2．8．3 三亲交配法将植物表达载体由大肠杆菌导入农杆菌 | 第51-52页 |
| 2．2．8．4 农杆菌介导的外源基因的转化 | 第52-54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-70页 |
| 3．1 橡胶树凝集因子（hevein）基因的分离与分析 | 第54-56页 |
| 3．2 橡胶树延伸因子（ref）基因的分离与分析 | 第56-57页 |
| 3．3 hevein基因Northern blot结果 | 第57-58页 |
| 3．4 ref基因Northern blot结果 | 第58页 |
| 3．5 hevein基因5’端启动子序列的分离分析 | 第58-62页 |
| 3．6 ref基因5’端启动子序列的分离分析 | 第62-64页 |
| 3．7 kmgl基因5’端启动子序列的分离分析 | 第64-66页 |
| 3．8 hevein基因启动子序列的系列缺失及嵌合植物表达载体的构建 | 第66-67页 |
| 3．9 ref基因启动子序列嵌合植物表达载体的构建 | 第67页 |
| 3．10 嵌合载体在橡胶树胶乳中瞬时表达的研究结果 | 第67-68页 |
| 3．10．1 pBI121，pBIH1，pBIH2，pBIH3，pBIH4，pBIR1在胶乳中瞬时表达的结果 | 第67-68页 |
| 3．10．2 ABA，乙烯利的梯度实验 | 第68页 |
| 3．10．3 ABA及乙烯利对pBI121，pBIH1，pBIH2，pBIH3，pBIH4，pBIR1的诱导表达结果 | 第68页 |
| 3．11 基因枪转化橡胶瞬时表达结果 | 第68-69页 |
| 3．12 嵌合载体转化烟草的研究结果 | 第69-70页 |
| 4 讨论 | 第70-73页 |
| 4．1 hevein，ref，hmgl启动子顺式作用元件分析 | 第70-71页 |
| 4．2 嵌合载体在胶乳中表达 | 第71页 |
| 4．3 基因枪转化橡胶瞬时表达研究 | 第71-72页 |
| 4．4 嵌合载体转化烟草的研究 | 第72-73页 |
| 5 结论 | 第73-75页 |
| 附录1． 基本培养基配方（mg/L） | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-86页 |
| 致谢 | 第86-90页 |
